瓜蔞提取物抗氧化藥效成分群的篩選與驗證

超氧陰離子自由基（O·）是O的活性代謝產(chǎn)物，與癌癥、代謝失調(diào)、消化系統(tǒng)疾病等多種疾病有關。氧自由基可影響細胞膜的流動性和通透性，破壞膜上酶和受體功能，是應激性胃潰瘍的重要致病因子并發(fā)揮重要作用，抗氧劑可減輕氧自由基對胃粘膜的損害。天然黃酮類化合物有著眾多的生理活性，其中減少自由基的形成和清除自由基是其重要生理活性之一。中藥總黃酮提取物可改善機體內(nèi)多余自由基所造成的損傷，對胃潰瘍有重要的保護作用。

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Maxim.）或雙邊栝樓（Harms）的干燥成熟果實，其種子和果皮分別作為瓜蔞子和瓜蔞皮入藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，瓜蔞提取物具有抗胃潰瘍的作用，而瓜蔞提取物中的黃酮類物質(zhì)可能是瓜蔞提取物抗胃潰瘍的活性成分。關于瓜蔞的抗氧化性，目前多限于瓜蔞多糖、多酚、瓜蔞子油及脂肪酸等成分或瓜蔞的不同提取溶劑的抗氧化性研究，未見關于瓜蔞總黃酮抗氧化特別是關于其抗氧化物質(zhì)基礎和藥效成分群篩選的研究報道。課題組前期制備了瓜蔞總黃酮提取物并擬進一步制備成胃內(nèi)速釋微丸用于胃潰瘍的治療。鑒于總黃酮抗氧化性與胃潰瘍之間重要的聯(lián)系，有必要探究瓜蔞提取物發(fā)揮抗氧化的物質(zhì)基礎。為此，本研究建立了瓜蔞提取物的HPLC指紋圖譜，測定了瓜蔞提取物對DPPH·、O·清除率，采用均值化鄧氏關聯(lián)度計算法研究瓜蔞提取物抗氧化的譜效關系并進行抗氧化藥效成分群的篩選、驗證分析，為瓜蔞提取物抗氧化的物質(zhì)基礎及藥效成分群的深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

島津LC-20A 高效液相色譜儀（含LC-20AT 四元泵、CTO-10AS 柱溫箱、SPD-M20A 檢測器）（日本島津公司）；AUW-220D 型電子天平（日本島津公司）；Heidolph-LR4010/4011旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國海道爾夫公司）；pHS-3C型pH計（上海越平科學儀器有限公司）。

目前很多國家對星載可展開天線機構(gòu)進行了研究。其中，ETS-VIII衛(wèi)星天線[1-2]是日本航空設計的兩個平面桁架系可展開機構(gòu)，于2006年12月26日發(fā)射成功。如圖1所示，天線由14個直徑4.8 m模塊組成，展開口徑為19.2 m×16.7 m，收攏高度和直徑為4 m×1 m，每個模塊由6個完全相同的肋組成。

1.2 實驗試劑

瓜蔞提取物（批號：smx20211001、smx20211002、smx20211003、smx20211004、smx20211005、smx20211006、smx20211007、smx20211008、smx20211009、smx20211010，皖南醫(yī)學院藥物制劑及質(zhì)量控制課題組）；DPPH（批號：201210075，成都格雷西亞化學技術有限公司）；蘆?。ㄅ枺?41208）、異槲皮苷（批號：140404）、山奈酚（批號：150929）均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度≥98.0%；木犀草素（批號：MO2-140513）、芹菜素（批號：QO2-140512）均購自中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，純度≥98.0%；其余試劑為分析純；純化水（自制）。

1.3 溶液的配制

1.3.1 DPPH溶液配制 取1.3 mg的DPPH，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，得0.13 mg/L的DPPH貯備液，備用。

水利施工現(xiàn)場由于具備顯著的復雜性，因此亟待對此予以綜合性的施工管理。通過推行現(xiàn)場施工監(jiān)管的舉措，應當能在根源上消除某些潛在隱患或者其他施工風險，確保水利建筑物應有的安全性并且杜絕某些額外的水利建設成本耗費。由此可見，施工現(xiàn)場管理舉措應當能夠滲透在全過程的水利施工中，其中包含了如下的施工現(xiàn)場管理關鍵技術：

取“1.6”項下高、中、低濃度（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）的樣品溶液，參考文獻［24］，分別各取樣品溶液1 mL于試管中，向其中依次加入2 mL 50 mmoL/L pH=8.2的Tris-HCl溶液緩沖液，混勻，于25 ℃恒溫水浴中保溫20 min后，取出立刻加入25 mmoL/L 鄰苯三酚溶液0.2 mL，迅速搖勻后于25 ℃恒溫水浴中反應5 min，加入10 mmoL/L的稀鹽酸0.3 mL，終止反應，于325 nm 處測定吸光度值A；以1 mL70%乙醇代替樣品溶液，重復以上操作測定吸光度值A；同樣，以去0.2 mL去離子水代替25 mmoL/L 鄰苯三酚溶液，測得各組的吸光度值，記為A。按式（2）計算各樣品對O·的清除率。

按“1.6”、“1.7”項下方法進行處理，測得10批瓜蔞提取物對DPPH·、O·清除率，結(jié)果見表2。

1.3.4 0.1 moL/L三氯化鋁溶液 取三氯化鋁1.3335 g，精密稱定，用5 mL蒸餾水將其溶解，再用無水乙醇定容至100 mL量瓶中，即得。

圖書館可采用舉辦講座、圖書館主頁、微信公眾平臺以及信息素養(yǎng)課等多種方式宣傳圖書預約服務，逐步培養(yǎng)在校生的圖書預約技能。

色譜柱：YMC-Pack ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），0～25 min：15%A～22%A，25～50 min：22%A～24%A，50～100 min：24%A～24%A；檢測波長：360 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL。

1.3.6 瓜蔞提取物的制備 參照課題組前期提取工藝，取瓜蔞（瓜蔞皮：瓜蔞子=2∶3），在40 ℃烘箱中烘干，精密稱定，按照料液比1∶10（g/mL），加入70%乙醇溶液，常溫下浸泡30 min，置于超聲清洗機（功率200 W，超聲頻率40 Hz）于40 ℃超聲提取3次，每次60 min，合并濾液，4 ℃下靜置12 h，過濾，取濾液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑得浸膏，用蒸餾水將浸膏轉(zhuǎn)移至冷凍干燥瓶中，冷凍干燥48 h，得瓜蔞提取物（共制備10批）。

1.3.7 瓜蔞提取物樣品溶液（抗氧化性測定用）取瓜蔞提取物凍干粉2.700 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，即得27 mg/mL的瓜蔞提取物樣品儲備液。

如果pts1,pts2,,ptsc為一組最底層并行工序任務串，其中任一并行工序任務串ptsb(1≤b≤c)可表示為ptsb={pthi,pth(i+1),,pthu}，pthi,pth(i+1),,pthu為ptsb中包含的工序任務，則ptsb的工時

第一，軍民融合知識產(chǎn)權轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化機制的建立是一項系統(tǒng)工程，必須整體設計、全面打造，確?？茖W有效。機制建立涉及國家、企業(yè)、當?shù)卣厣线B著技術、資金、知識產(chǎn)權、互聯(lián)網(wǎng)生態(tài)，必須精心設計，全面打造。要堅持政府引導，爭取設立專項基金、引導基金等方式，促進知識產(chǎn)權轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化；堅持縱橫聯(lián)動，充分發(fā)揮中央與地方、行業(yè)上下、軍民之間的聯(lián)動，在資源配置、任務部署等方面形成合力；堅持機制創(chuàng)新，圍繞技術、專利、人才、資本等要素，設置知識產(chǎn)權轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化機制研究相關子課題，分工協(xié)作和深入研究，形成系列機制創(chuàng)新成果。

1.強責任意識，促青年普法服務平臺建設。公開選拔優(yōu)秀年輕干部，組建起“國土講師團”隊伍，深入鎮(zhèn)、村（社區(qū)）等基層一線開展宣講，主動幫助基層干部群眾增強對國土法律法規(guī)政策及業(yè)務知識的了解和掌握。自組建以來，“國土講師團”已赴龍山、掌起、宗漢、勝山、附海等地開展專題宣講，參加人數(shù)高達520人次，深受基層鎮(zhèn)村干部和群眾的歡迎。

1.3.8 瓜蔞提取物樣品溶液（HPLC指紋圖譜測定用）取瓜蔞提取物凍干粉5.00 g，精密稱定，用20 mL蒸餾水溶解，等量乙酸乙酯超聲萃取3次，20 min/次，合并乙酸乙酯層并回收溶劑，殘渣用甲醇定容至5 mL。

1.4 瓜蔞提取物HPLC指紋圖譜的色譜條件

1.3.5 混合對照品溶液的制備 取山奈酚10.5 mg、異槲皮苷10.6 mg、木犀草素10.4 mg、蘆丁10.4 mg、芹菜素10.4 mg，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，制得對照品儲備液。精密量取各儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.5 指紋圖譜的建立

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.130723版本）建立瓜蔞提取物的HPLC指紋圖譜并進行共有峰匹配。

1.6 DPPH·清除能力的測定

2.3.1 關聯(lián)度 根據(jù)10批瓜蔞提取物指紋圖譜色譜峰的峰面積均一化值和10批瓜蔞提取物對DPPH·、O·清除率測定結(jié)果，參照文獻［19,25］，采用Matlab 2014a語言自編均值化鄧氏關聯(lián)度計算法程序，計算瓜蔞提取物指紋圖譜36個共有峰與DPPH·、O·清除率的關聯(lián)度（圖3）。

1.7 O2-·清除能力的測定

1.3.2 Tris-HCl溶液（50 mmoL/L）取0.606 g的三羥甲基氨基甲烷，精密稱定，置于100 mL 小燒杯中，加入80 mL去離子水，充分攪拌混勻溶解，用10 mmoL/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH=8.2，最后將溶液定容至100 mL，室溫保存，即得50 mmoL/LTris-HCl溶液。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞提取物的HPLC指紋圖譜

按照“1.4”項下瓜蔞提取物HPLC指紋圖譜的色譜條件，建立瓜蔞提取物的HPLC指紋圖譜及混合對照品的色譜圖（圖1）。其中5號峰為蘆丁，8號峰為異槲皮苷，31號峰為木犀草素，35號峰為芹菜素，36號峰為山奈酚。選擇1號樣品（S1）為參照樣品，經(jīng)Mark峰匹配，獲得36個共有色譜峰（以下簡稱共有峰），并對36個共有峰的峰面積采用均值化法處理（圖2、表1）。

2.2 DPPH·、O2-·清除率測定的結(jié)果分析

1.3.3 鄰苯三酚溶液（25 mmoL/L）取0.1575 g鄰苯三酚，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加入去離子水溶解并定容，即得25 mmoL/L鄰苯三酚溶液。

2.3 瓜蔞提取物抗氧化的譜效關系及藥效成分群的確認

取各批號瓜蔞提取物，分別按“1.3.7”項下瓜蔞提取物樣品溶液（抗氧化性測定用）制備成高、中、低濃度（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）的樣品溶液。參考文獻［21-23］，分別各取樣品溶液1 mL于試管中，再分別加入3 mL DPPH貯備液，搖勻，室溫下避光放置30 min，以70%乙醇為參比，在517 nm處測定吸光度值，記為A；以1 mL 70%乙醇代替樣品溶液，重復以上操作測定吸光度值，記為A；同樣，以3 mL 70%乙醇代替DPPH溶液，測得各組的吸光度值，記為A。按式（1）計算各樣品對DPPH·的清除率。

對于中藥材需求的加劇造成中藥材野生資源大量消耗，并導致生態(tài)平衡遭到破壞，藥用珍惜瀕危物種持續(xù)增加[42]。目前，多數(shù)中藥材資源逐漸進行由野生到家種的轉(zhuǎn)變，以人工栽培資源代替野生資源。但由于中藥材具道地性，各地栽培黃芩種質(zhì)、生態(tài)因子、田間管理差異，易造成市售黃芩質(zhì)量不一，降低黃芩有效藥材比例，影響黃芩進一步擴大市場。構(gòu)建黃芩“無公害栽培體系”，自選擇優(yōu)良黃芩種質(zhì)開始，結(jié)合最適生態(tài)因子篩選、田間管理及病蟲害綜合防治，旨在為中藥材市場提供無農(nóng)藥、重金屬及有害元素等多種對人體有毒物質(zhì)的殘留量均在限定的范圍以內(nèi)的黃芩資源。

2.3.2 關聯(lián)序 根據(jù)瓜蔞提取物36 個共有峰及其對DPPH·、O·清除率間關聯(lián)度，將36個共有峰按關聯(lián)度由大到小排序，組成關聯(lián)序，并依次標注關聯(lián)序號（按關聯(lián)度大小的排序）。瓜蔞提取物溶液（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）對DPPH·、O·清除率關聯(lián)序號前18位的共有峰均依次為：21、36、8、31、14、5、27、2、24、15、18、33、22、34、35、19、28、25號色譜峰。

2.3.3 抗氧化物質(zhì)基礎的認定 以瓜蔞提取物（3 mg/mL）對DPPH·的關聯(lián)度不低于0.9705（關聯(lián)度的中位數(shù)值）以及對O·的關聯(lián)度不低于0.8089（關聯(lián)度的中位數(shù)值）計，均為關聯(lián)序號位于前18位的色譜峰符合要求。為此，認定21、36、8、31、14、5、27、2、24、15、18、33、22、34、35、19、28、25號色譜峰對應的化學成分（簡稱18成分）為瓜蔞提取物抗氧化的主要物質(zhì)基礎。

2.4 抗氧化藥效成分群對DPPH·、O2-·清除率的測定

2.4.1 抗氧化藥效成分群的篩選 36號峰（山奈酚）、8號峰（異槲皮苷）、31號峰（木犀草素）、5號峰（蘆?。?、35號峰（芹菜素）為瓜蔞提取物抗氧化主要物質(zhì)基礎中的重要已知成分，關聯(lián)序號分別為2、3、4、6、15，在36個色譜峰中與抗氧化性的關聯(lián)強度較高。為此，選取以上5種已知成分為瓜蔞提取物的抗氧化藥效成分群（即抗氧化藥效成分群，簡稱山奈酚等）。取山奈酚等5種成分的單體化合物，按瓜蔞提取物中各單體化合物的比例及瓜蔞提取物中總黃酮的含量制備山奈酚等混合對照品溶液并進行DPPH·、O·清除率測定，以驗證抗氧化藥效成分群抗氧化的效果

今年，由他研發(fā)的APP經(jīng)過一段時間推行后，使用軟件的焊工、技術員比不使用的每天可節(jié)約1.5小時。大家看到軟件帶來的好處后，開始慢慢接受新的理念和管理方式。項目部分階段取消了紙質(zhì)版焊材領用卡。很快，兩個軟件在十建項目現(xiàn)場全面使用，并取得了很好的效果。今年3月份，十建組織各項目部來創(chuàng)新觀摩，并將該項目部定為創(chuàng)新基地。

2.4.2 抗氧化藥效成分群溶液的制備及濃度的確定 課題組前期采用高效液相色譜法對瓜蔞提取物的化學指紋圖譜及蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷和山奈酚5種混合對照品進行了分析，研究結(jié)果表明瓜蔞提取物中山奈酚：異槲皮苷∶木犀草素∶蘆丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（質(zhì)量比）。同時采用紫外-可見分光光度法建立了瓜蔞提取物總黃酮的含量測定方法。

取蘆丁10.5 mg、木犀草素10.4 mg、芹菜素10.4 mg、異槲皮苷10.6 mg、山奈酚10.5 mg，精密稱定，分別置于50 mL 量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，制得濃度 分別為0.21 mg/mL、0.208 mg/mL、0.208 mg/mL、0.212 mg/mL、0.21 mg/mL的蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚對照品儲備液；按山奈酚∶異槲皮苷∶木犀草素∶蘆丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（質(zhì)量比），分別精密量取蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚對照品儲備液適量至10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，制得濃度為36.21μg/mL的混合對照品溶液（每mL含蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚對照品的質(zhì)量合計為36.21μg）。根據(jù)瓜蔞提取物的濃度（27 mg/mL、9 mg/mL、3 mg/mL）及其總黃酮的含量（6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL），將混合對照品溶液依次稀釋成6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL作為抗氧化藥效成分群。

2.4.3 抗氧化藥效成分群對DPPH·、O·清除率測定結(jié)果 取“2.4.2”項下混合對照品高、中、低濃度（6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL）溶液，參照“1.6”、“1.7”項下方法分別測定抗氧化藥效成分群對DPPH·、O·清除率（表3）。

計算高、中、低濃度的抗氧化藥效成分群與其相應濃度的瓜蔞提取物對DPPH·、O·的清除率的比值（Q/Q）（表4）。

由表4可知，高、中、低濃度的抗氧化藥效成分群與其相應濃度的瓜蔞提取物對DPPH·的清除率的比值（Q/Q）分別為71.5%、71.5%、69.7%，說明抗氧化藥效成分群與瓜蔞提取物對DPPH·的清除率基本相當，抗氧化藥效成分群可較好反映瓜蔞提取物對DPPH·的清除率。高、中、低濃度的抗氧化藥效成分群與其相應濃度的瓜蔞提取物對O·的清除率的比值（Q/Q）分別為13.0%、20.1%、42.6%，該比值受瓜蔞提取物濃度影響較大，隨著瓜蔞提取物濃度降低，比值顯著增大，抗氧化藥效成分群與瓜蔞提取物對O·的清除率逐漸接近。

3 討論

黃酮類化合物具有保護胃粘膜、抗實驗性胃潰瘍等作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，瓜蔞提取物具有抗胃潰瘍的作用，而瓜蔞提取物中的黃酮類物質(zhì)可能是瓜蔞提取物抗胃潰瘍的活性成分。藥物的抗氧化性是其發(fā)揮抗胃潰瘍的重要途徑之一。

研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞提取物濃度為27、9、3 mg/mL 時，對DPPH·的清除率分別為（91.5±0.36）%、（89.5±0.28）%和（87.5±0.35）%，有一定的量效關系；對O·清除率分別為（99.0±0.18）%、（48.8±1.45）%和（19.5±1.51）%，有明顯的量效關系。相同濃度的瓜蔞提取物對DPPH·和O·清除率的量效關系并不一致，原因可能為黃酮類化合物清除自由基的能力與每種化合物自身結(jié)構(gòu)密切相關，如B環(huán)的羥基化程度，特別是B環(huán)含鄰位酚羥基黃酮類化合物可與自由基反應形成共軛半醌式自由基并中斷游離自由基的鏈式反應，所以具有較強的抗氧化性；而糖苷基團較大的化合物如蘆丁，由于受空間位阻的影響，可能會屏蔽或阻礙B環(huán)3、4-OH，使其對DPPH·清除率降低；而糖苷對清除O·有貢獻，其作用大小因糖苷的種類而異。因而不同的黃酮類化合物可能對不同體系呈現(xiàn)出不同的抗氧化作用，也對不同類型的自由基存在選擇性作用。

通過對瓜蔞提取物指紋圖譜與DPPH·和O·關聯(lián)度的分析，可知瓜蔞提取物中不同成分對抗氧化性的貢獻程度不同。同時發(fā)現(xiàn)抗氧化藥效成分群可較好反映瓜蔞提取物對DPPH·的清除率，但與瓜蔞提取物對O·清除率的測定結(jié)果相差較大，原因可能為瓜蔞提取物中其它成分與山奈酚等對O·清除率產(chǎn)生了協(xié)同作用。結(jié)合瓜蔞提取物高、中、低濃度對O·清除率的量效關系明顯，分析可能起協(xié)同作用的物質(zhì)含量較低，因此在瓜蔞提取物高濃度時，對O·清除率較高，隨著瓜蔞提取物濃度的降低，起協(xié)同作用的物質(zhì)含量快速降低，協(xié)同作用也迅速減弱，對O·清除率也快速降低，因此呈現(xiàn)瓜蔞提取物對O·清除率隨溶液濃度降低而快速下降的實驗結(jié)果。而抗氧化藥效成分群中，因為沒有協(xié)同物質(zhì)的存在，導致其對O·清除率較低，但對O·清除率隨抗氧化藥效成分群濃度降低下降較為緩慢。

綜合分析，篩選山奈酚∶異槲皮苷∶木犀草素∶蘆丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（質(zhì)量比）作為瓜蔞提取物的抗氧化藥效成分群。但應強調(diào)的是：藥效成分群對某些類型自由基抗氧化作用的充分發(fā)揮需要有其它成分的協(xié)同作用，這也體現(xiàn)了中藥是以多成分協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的特點。在重視并完善抗氧化藥效成分群研究的基礎上，有待進一步對起協(xié)同抗氧化作用的物質(zhì)進行深入研究。