金槍魚油精制及低溫結晶法富集甘油三酯型EPA、DHA

鄭飛洋，戴志遠，2*，崔益瑋，鄭振霄，2，朱 凱，郭麗平

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012）

金槍魚油中含有豐富的ω-3 系列多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），主要包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。EPA 和DHA 具有廣泛的生理作用，其中EPA 作為“血管清除劑”，可以降低血脂和膽固醇，預防心血管疾病，還可以抑制血小板凝聚，防止血栓形成[1-2]。DHA 作為“腦保護劑”，有增強記憶力，改善大腦的功能，還可以促進嬰幼兒大腦和視覺系統(tǒng)發(fā)育，提高嬰兒認知能力、語言能力、眼手協(xié)調能力[3-6]。此外，EPA 和DHA 在炎癥、癌癥、抑郁癥治療方面也有顯著效果，被廣泛應用于醫(yī)藥和功能食品領域[7-11]。研究表明，人體中的α-亞麻酸（ALA）可通過脫氫、碳鏈延長反應轉化為EPA 或DHA，然而參與轉化的ALA 通常低于10%，不能滿足人體正常所需，需要從外界攝入EPA 和DHA[12-13]。目前市場上售賣的EPA 和DHA 產(chǎn)品大多為甲酯或乙酯型，臨床實驗表明，相較前兩者，甘油酯型的EPA 和DHA 更易被人體吸收轉化[14-15]。

目前，魚油中多不飽和脂肪酸富集分離方法主要有分子蒸餾法、尿素包合法、脂肪酶法、色譜法、超臨界流體萃取法等[16-20]。低溫結晶法是一種有效富集多不飽和脂肪酸的方法，其原理是根據(jù)不同結構的脂肪酸在不同溫度和有機溶劑中溶解度的差異進行分離[21]。該方法操作簡便，設備要求低，有機試劑可回收利用且低溫降低了PUFA 變性的風險，常用于富集植物油中甘油酯型PUFA或魚油中游離型PUFA。有關低溫結晶法富集魚油中甘油酯型EPA 和DHA 報道較少。

本文采用低溫結晶法富集精制魚油中甘油酯型EPA 和DHA，從多個方面優(yōu)化富集方法，測定脂肪酸組成的變化，旨在為甘油酯型多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚油，舟山豐宇海洋生物制品有限公司；活性白土，濟南建輝化工有限公司；37 種脂肪酸混標，上海安普科學儀器有限公司；十六烷酸甘油一酯標準品、十七碳烯酸甘油二酯標準品、十八碳二烯酸甘油三酯標準品，上海安普實驗科技有限公司。氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、三氟化硼-甲醇、正己烷、異丙醇、乙醇、丙酮、乙腈、甲醇等均為分析純，國藥試劑有限公司；正己烷、異丙醇、乙腈均為色譜純，常青化工有限公司。

1.2 設備與儀器

MS-H380-Pro 磁力攪拌器，浙江簡然儀器設備有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Thermosorvall LYNX4000高速落地離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Thermo 900 超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-11-2 恒溫水浴鍋，上海奧旗儀器設備有限公司；2695 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金槍魚油的精制 魚油的脫膠、脫酸、脫色、脫臭工藝參考Chakraborty 等[22]、Simat 等[23]。

1.3.2 魚油理化指標的測定 水分及揮發(fā)物：參照GB/T 5528-2008 測定；酸價：參照GB/T 5530-2005 測定；過氧化值：參照GB/T 5538-2005 測定；碘值：參照GB/T 5532-2008 測定；不溶性雜質：參考GB/T 15688-2008。

1.3.3 高效液相色譜條件 色譜柱：Sunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈，流動相B：含有10 mmol/L 甲酸銨的異丙醇溶液（異丙醇與甲酸銨體積比為98∶2）；流速為0.6 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫為25 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～25 min，90%A；25～30 min，40%A；30～50 min，0%A；50 min 之后，90%A。

1.3.4 魚油甲酯化 將100 mg 魚油于具塞試管中，加入2 mL 的NaOH-CH3OH 溶液（0.5 mol/L），充分振蕩搖勻。在65 ℃的水浴鍋中加熱30 min，取出后冷卻至室溫。繼續(xù)加入2 mL 的BF3-CH3OH溶液（10%），充分振蕩混勻。在65 ℃水浴鍋中繼續(xù)加熱3 min，取出并自然冷卻加入2 mL 正己烷，接著加入2 mL 飽和NaCl 溶液，取出上清液后在其中加入適量無水Na2SO4，過有機濾膜后用氣相色譜分析。

1.3.5 氣相色譜條件 色譜柱：HP-88 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；柱箱溫度：70 ℃；前進樣口溫度：250 ℃；前檢測器溫度：220 ℃；尾吹氣：高純氮氣；恒定燃氣：高純氫氣；恒流：0.65 mL/min；進樣量：1 μL；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至220 ℃維持15 min。

1.3.6 精制魚油的低溫結晶 稱取一定量的精制后的金槍魚油，加入不同比例與種類的有機溶劑，在玻璃棒的攪拌下形成均勻混合層。將樣品置于不同溫度中低溫結晶，一段時間后在低溫環(huán)境下進行真空抽濾，分離得固態(tài)的結晶物和濾液。分離收集得固態(tài)結晶物和濾液，并將二者于60 ℃條件下旋轉蒸發(fā)除去溶劑。

1.3.7 計算EPA 或DHA 得率

式中：YEPAorDHA——EPA 或DHA 得率，%；mlors——濾液或固相中魚油的質量，mg；AEPAtorDHAt——冷凍結晶一段時間后濾液或固相魚油中EPA 或DHA 所占百分比，%；mo——初始添加魚油的質量，mg；AEPAoorDHAo——初始魚油中EPA 或DHA 所占百分比，%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

液相色譜數(shù)據(jù)采集與分析采用美國Waters公司Empower 軟件；氣相色譜數(shù)據(jù)采集與分析采用美國Agilent 公司OpenLab 軟件，并用歸一化法進行定量分析。采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，所有試驗均重復3 次，相關測定數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差來表示，P＜0.05 表示有顯著性差異；采用Origin 9.1 軟件作圖分析。

2 結果與討論

2.1 金槍魚油品質及脂肪酸組成

粗魚油和精制魚油的理化指標如表1所示，粗魚油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭工藝后各項理化指標都有所改善，其中精制后的魚油外觀呈淺黃色且無沉淀，酸敗味消失，酸值、過氧化值、水分及揮發(fā)物、不溶性雜質4 項指標均下降，碘值上升，達到了水產(chǎn)行業(yè)一級魚油的質量標準。

表1 粗魚油與精制魚油理化指標Table 1 The physicochemical indexes of the crude and refined fish oil

粗魚油與精制魚油主要脂肪酸組成如表2所示，金槍魚油中脂肪酸種類豐富，含有16 種脂肪酸。精制過程中飽和脂肪酸 （saturated fatty acids，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）、PUFA 的含量各有變化，其中SFA 含量呈下降趨勢，降至30.97%，這表明了精制工藝可以有效降低SFA 的含量；精制過后MUFA 所占比例最高，達到36.26%，有研究指出油脂的脫臭工藝是反式異構體的主要來源，但精制過后C18：1 trans 的含量略有下降，而C18：1 cis 的含量有所上升，此結果表明此精制方法一定程度上降低了反式脂肪酸的生成[24]；MUFA 含量呈上升趨勢，升至32.26%，并且目標產(chǎn)物EPA 和DHA含量都有所上升，分別達到了6.69%和16.46%。

表2 粗魚油與精制魚油主要脂肪酸組成Table 2 Main fatty acids composition of the crude and refined fish oil

精制魚油的液相色譜圖如圖1所示，精制后的魚油中只有1.14%的甘油一酯（出峰時間在0～10 min）和1.24%的甘油二酯（出峰時間在15～20 min），與前兩者相比，占比97.62%的甘油三酯（出峰時間在20 min 之后）才是甘油酯型魚油的主要成分。此結果表明，精制后的金槍魚油符合試驗材料的要求。

圖1 精制魚油的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of refined fish oil

2.2 低溫結晶法富集甘油三酯型EPA 和DHA

2.2.1 不同溶劑對富集效果的影響 本研究首先考察了無溶劑條件下魚油低溫結晶的可行性。精制魚油在溫度-10 ℃下，低溫結晶12 h 后發(fā)現(xiàn)容器內的魚油都凝結成固體，真空抽濾后難以實現(xiàn)固體結晶物與濾液有效分離。因此，為保證甘油三酯型EPA 和DHA 能有效富集，應在低溫結晶試驗中添加合適的有機溶劑。

正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇等是低溫結晶法富集游離型PUFA 時常用的溶劑，其中乙腈的富集效果最佳[25]。但由于甘油三酯的極性小于游離型脂肪酸，導致甘油三酯與乙腈、甲醇等極性較大的溶劑混溶時難以形成均勻混合層，在前人富集甘油酯型PUFA 的研究中，正己烷與丙酮是較為理想的溶劑[26]。因此，試驗首先使用單一溶劑正己烷、乙醚、異丙醇、丙酮作為低溫結晶溶劑，在結晶溫度-20 ℃，魚油與溶劑比7∶40（V/V）的條件下，冷凍結晶12 h，考察不同溶劑類型對甘油酯型EPA 和DHA 含量和得率的影響。如圖2a 和2b所示，丙酮對EPA 和DHA 富集效果較好，富集后EPA 和DHA 的含量分別達到了 （8.65±0.13）%和（20.55±0.03）%，此結論與Yokochi 等[27]的研究相似。但當使用異丙醇富集時，EPA 和DHA 的得率較低，原因可能是異丙醇黏度大，低溫結晶時大量液態(tài)的甘油三酯滯留在結晶物中，導致固液分離不完全。在其它試驗條件相同的情況下，考察了正己烷、乙醇、乙腈、甲醇分別與丙酮復配后（復合溶劑體積比均為1∶11），對EPA 和DHA 含量及得率的影響。如圖2c 和2d 所示，當丙酮通過與正己烷復配降低混合物體系極性時，正己烷與丙酮組的EPA 和DHA 含量低于單一溶劑丙酮組，此結論與Mu 等[28]一致；當丙酮通過分別與乙醇、乙腈、甲醇復配增大混合物體系極性時，各組EPA 和DHA的含量均高于單一溶劑丙酮組，其中乙腈與丙酮組富集效果最佳，EPA 和DHA 的含量分別達到了（9.89±0.02）%和（22.23±0.58）%，但 其EPA 和DHA 的得率比丙酮組分別低了（16.88±0.10）%和（18.95±1.15）%。因此，分別選擇單一溶劑中的丙酮和復合溶劑中的乙腈與丙酮作為低溫結晶的溶劑繼續(xù)試驗。

圖2 不同溶劑對EPA 和DHA 含量和得率的影響Fig.2 Effects of different solvents on the content and yield of EPA and DHA

2.2.2 結晶溫度對富集效果的影響 溫度是低溫結晶法富集PUFA 重要的工藝參數(shù)之一，Morales等[29]構建了低溫結晶法溫度-時間傳質模型，在相同結晶時間條件下，隨著溫度降低PUFA 含量逐漸升高，并且在-85 ℃結晶24 h 后液相油中PUFA達到了83.4%，與原油相比提高了37.9%。本研究中使用單一溶劑丙酮和復合溶劑乙腈與丙酮作為低溫結晶溶劑，魚油與溶劑比7∶40（V/V），乙腈與丙酮復配比1∶11（V/V），依次在結晶溫度-10，-30，-50，-70 ℃的條件下，冷凍結晶12 h，考察不同溫度對甘油三酯型EPA 和DHA 含量和得率的影響。如圖3所示，EPA 和DHA 含量都隨著溫度降低而增加，EPA 和DHA 得率都隨溫度降低而減小。在4 個溫度梯度中，復合溶劑乙腈與丙酮對EPA 和DHA 含量的提升均高于單一溶劑丙酮。當溫度從-30 ℃降至-50 ℃，EPA 和DHA 的含量增長最多。當溫度降低至-70 ℃，EPA 和DHA 的含量雖然繼續(xù)增長，但其增長量下降。并且，當溫度為-50 ℃時，復合溶劑乙腈與丙酮的EPA 和DHA的含量分別達到了（14.62±0.69）%和（31.07±1.25）%，相較于單一溶劑，EPA 和DHA 得率雖然下降（6.30±3.17）%和（5.08±4.56）%，但其含量卻上升了（2.09±0.32）%和（3.00±0.79）%。因此綜合考慮，結晶溫度選擇-50 ℃，低溫結晶溶劑選擇復合溶劑乙腈與丙酮。

圖3 不同結晶溫度對EPA 和DHA 含量和得率的影響Fig.3 Effects of different crystallization temperatures on the content and yield of EPA and DHA

2.2.3 乙腈與丙酮復配比例和魚油與該復合溶劑之比對富集效果的影響 前人研究表明，低溫結晶法富集PUFA 時，合適的復合溶劑復配比和魚油與溶劑比會產(chǎn)生亞穩(wěn)溶液，有助于晶體自然生長，而過高的魚油與溶劑比可能會產(chǎn)生過飽和溶液，降低目標產(chǎn)物的得率[30]。因此，本研究在魚油與溶劑體積比為7∶40、7∶80、7∶120，其中乙腈與丙酮復配比例（體積比）為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12 的條件下，以乙腈與丙酮作為低溫結晶溶劑，結晶溫度-50 ℃，低溫結晶12 h，考察不同乙腈與丙酮復配比和油溶比對甘油三酯型EPA 和DHA 含量和得率的影響。如圖4所示，通過降低乙腈與丙酮復配比或油溶比，都能達到提高EPA 和DHA 的得率和降低EPA 和DHA 的含量的效果。原因在于降低乙腈與丙酮復配比或魚油與溶劑比會使混合體系的極性逐漸減小，導致了一些SFA 和MUFA不易結晶析出，從而留在液相油中。該結論與Mu等[28]、Fabritius 等[31]、Vázquez 等[30]的結果相似。當魚油與溶劑比為7∶40（V/V），乙腈與丙酮復配比為1∶3（V/V）時，EPA 和DHA 含量達到最大，分別為（16.62±0.47）%、（34.13±0.62）%，但在此時EPA和DHA 的得率降至最低，分別為（10.68±3.33）%、（8.92±4.53）%。在此魚油與溶劑比下，雖然通過降低乙腈與丙酮復配比可以提高EPA 和DHA 的得率，但在4 組復配比中EPA 和DHA 得率均低于20%。當魚油與溶劑比為7∶120（V/V）時，乙腈與丙酮復配比為1∶12（V/V），EPA 和DHA 得率上升至最高，分別為（35.65±0.90）%、（33.07±1.07）%，但在此時EPA 和DHA 的含量降至最低，分別為（28.80±0.09）%、（12.62±0.06）%。并且，從經(jīng)濟性角度來看，魚油與溶劑比為7∶120（V/V）時，溶劑消耗量過大。較前兩種魚油與溶劑比，7∶80（V/V）的魚油與溶劑比既減少了溶劑使用量，又在一定程度上保證了EPA 和DHA 含量與得率。其中，當乙腈與丙酮復配比1∶12（V/V）時，EPA 和DHA的富集效果最佳，兩者含量和得率分別為（13.36±0.23）%、（30.24±0.72）%和（28.96±1.97）%、（26.64±2.77）%。因此綜合考慮，乙腈與丙酮復配比例選擇1∶12（V/V），魚油與溶劑比選擇7∶80（V/V）。

圖4 不同復配溶劑比（V/V）和魚油與溶劑比（V/V）對EPA 和DHA 含量和得率的影響Fig.4 Effects of different mixed solvent ratio （V/V） and fish oil solvent ratio （V/V） on the content and yield of EPA and DHA

2.2.4 結晶時間對富集效果的影響 分別從低溫結晶時間為30，90，150，210，270，330 min 考察了魚油在不同結晶時間后固液兩相中脂肪酸的變化以及不同結晶時間對甘油三酯型EPA 和DHA 含量和得率的影響，其中以乙腈與丙酮作為低溫結晶溶劑，結晶溫度-50 ℃，魚油與溶劑比7∶80（V/V），乙腈與丙酮比為1∶12（V/V）。如表3和圖5a所示，隨著結晶時間的延長，液相的魚油中SFA含量逐漸減少，MUFA 含量在30 min 時略有上升，之后又逐漸減小，PUFA 含量逐漸升高。其中，雖然PUFA 含量隨著結晶時間變長而增多，但隨著結晶時間的延長，其富集難度越來越大。結晶時間在150 min 之前，PUFA 含量增長了 （19.35±0.47）%，而150 min 之后其增長量僅有（2.24±0.20）%。如圖6所示，EPA 和DHA 的含量的增長趨勢與PUFA的增長趨勢類似，并且當結晶時間為150 min 時，EPA 和DHA 的得率顯著（P＜0.05）高于結晶時間210，270，330 min 的得率。如表4和圖5b 所示，固相的魚油中SFA 含量逐漸減少，而MUFA、PUFA含量雖都低于精制魚油，但兩者含量的總體趨勢逐漸上升。這可能與魚油中脂肪酸的組成含量有關，精制魚油的PUFA 含量只有（32.26±0.61）%，而前人研究中藻油、沙丁魚油中所含PUFA 含量分別高達61.00%，45.50%[28-29]。由于甘油三酯的結晶行為通常反映出脂肪酸的組成，相同條件下，原料油中較低含量的PUFA 會在低溫下更易結晶而且會形成更多的結晶物，且隨著結晶時間延長，低溫會使更多液相的甘油三酯留在結晶物的空隙中，導致了固液分離不完全，從而降低了目標產(chǎn)物的得率[32]。雖然縮短結晶時間會減少留在結晶物空隙中的液態(tài)甘油酯含量，但此措施會導致大量SFA 和MUFA 結晶不完全，從而留在液相油中。因此綜合考慮，選擇150 min 為最佳結晶時間。

圖5 不同結晶時間后魚油液固兩相中脂肪酸含量變化Fig.5 Changes of fatty acid content in liquid and solid phases of fish oil after different crystallization time

圖6 不同結晶時間對EPA 和DHA 含量和得率的影響Fig.6 Effect of different crystallization time on the content and yield of EPA and DHA

表3 魚油在不同結晶時間后液相中主要脂肪酸含量變化Table 3 Changes of main fatty acids content in liquid phase of fish oil after different crystallization time

表4 魚油在不同結晶時間后固相中主要脂肪酸含量變化Table 4 Changes of main fatty acids content in solid phase of fish oil after different crystallization time

2.2.5 精制魚油與低溫結晶最優(yōu)條件下富集魚油主要脂肪酸含量比較 精制魚油與最優(yōu)條件下富集后的魚油氣相圖及其主要脂肪酸如圖7和表5所示，SFA、MUFA 含量下降，PUFA 含量上升。其中，C16∶0 含量下降和DHA 含量上升最為明顯，分別下降了13.85%和上升了12.18%，但富集后的魚油中仍含有大量的C14∶0、C16∶0、C18∶1cis。出現(xiàn)此結果的原因可能與甘油三酯的結構有關，一些C14∶0、C16∶0、C18∶1cis 和EPA、DHA 連在同一個甘油骨架上，當富集EPA 與DHA 時，C14∶0、C16∶0、C18∶1cis 也會與EPA 和DHA 保留在同一個甘油骨架上，在不改變甘油三酯結構的前提下，難以將C14∶0、C16∶0、C18∶1cis 等脂肪酸與EPA 和DHA 完全分離[33]。因此，單一的富集方法難以將EPA 和DHA 的含量進一步提高，后續(xù)可結合其它富集分離技術，以獲得更高純度的甘油三酯型EPA 和DHA。

圖7 精制魚油與富集魚油氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatography of refined and enriched fish oil

表5 精制魚油與富集魚油氣相色譜圖中主要脂肪酸峰面積比Table 5 Peak area ratio of main fatty acids in gas chromatograms of refined fish oil and enriched fish oil

3 結論

精制過后的金槍魚油各項理化指標都有所改善，達到了水產(chǎn)行業(yè)一級魚油的質量標準。飽和脂肪酸含量下降，單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸上升，EPA 和DHA 的含量上升至6.69%和16.46%。

以精制金槍魚油為原料，采用低溫結晶法富集甘油三酯EPA 和DHA，確定最佳工藝條件為：低溫結晶溶劑為乙腈與丙酮，結晶溫度-50 ℃，乙腈與丙酮復配比1∶12（V/V），魚油與溶劑比7∶80（V/V，結晶時間150 min。在此條件下，EPA 與DHA 含量分別為（12.83±0.34）%和（28.70±0.48）%，得率分別為（40.10±1.07）%和（36.52±2.53）%。

雖然，低溫結晶后的金槍魚油中EPA 和DHA含量與原油相比有了顯著提高（P＜0.05），但兩者得率都未超過50%，而且固相中還殘留著較多EPA 和DHA。因此，可將低溫結晶法與其它脂肪酸分離純化的方法結合起來，進一步提高魚油中EPA 和DHA 含量、產(chǎn)率及其利用率。