麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎損傷的保護(hù)作用

趙 肅，潘 龍，吳興泉，廖愛(ài)美，黃繼紅，2*

（1 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州 450001 2 許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院 河南許昌 461000 3 鄭州糧食批發(fā)市場(chǎng) 鄭州 450001）

亞硝酸鹽是食品工業(yè)中常用的食品添加劑，在肉制品加工過(guò)程中起增味、著色和抑菌等作用[1]。此外，它被用作工業(yè)生產(chǎn)中亞硝基化合物、染料以及橡膠等化學(xué)產(chǎn)品[2]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，氮肥的大量使用、工業(yè)污水/廢水處理不當(dāng)以及食品中添加未加控制的亞硝酸鹽，導(dǎo)致人類(lèi)暴露于亞硝酸鹽的幾率大大增加。亞硝酸鹽在低濃度下對(duì)人體有良好的生理作用，它是一氧化氮合成的前體物質(zhì)，用作血管擴(kuò)張劑、支氣管擴(kuò)張劑以及氰化物中毒的治療劑[3]。然而，高濃度亞硝酸鹽會(huì)產(chǎn)生毒性作用，包括細(xì)胞毒性、胚胎毒性和致畸性[4]。

最近針對(duì)人類(lèi)飲食中的天然產(chǎn)物作為預(yù)防嚴(yán)重疾病的化學(xué)替代方法來(lái)減輕身體毒性成為研究熱點(diǎn)。Al-Brakati 等[5]研究表明黑種草籽油中的植物化學(xué)成分百里香醌和伊布硒能增強(qiáng)腎組織內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)活性，抑制亞硝酸鹽引起的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡，減少腎組織損傷。多酚提取天然產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和清除自由基。Cheng 等[6]研究表明，酚類(lèi)化合物綠原酸（chlorogenic acid，CGA）能夠降低大鼠體內(nèi)的高鐵血紅蛋白水平，避免亞硝酸鹽引起的細(xì)胞膜損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化以及氧化應(yīng)激。長(zhǎng)期口服5 mg/kg 大蒜油（garlic oil）能夠改善大鼠認(rèn)知功能，減輕亞硝酸鈉對(duì)大腦造成的神經(jīng)毒性損傷，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[7]。此外，大蒜油還可以降低大鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransfease，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）以及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等肝、腎標(biāo)志物水平[8]。

麥胚球蛋白（wheat-embryo globulin，WEG）是脫脂麥胚中提取的一種蛋白質(zhì)，氨基酸比例均衡，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老等作用，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的蛋白質(zhì)資源[9-11]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外研究主要集中于球蛋白營(yíng)養(yǎng)功能開(kāi)發(fā)，而對(duì)于麥胚球蛋白預(yù)防亞硝酸鹽危害的關(guān)注較少。根據(jù)之前報(bào)道亞硝酸鹽中毒會(huì)引起腎損傷[12]，本文以麥胚球蛋白為研究對(duì)象，探討麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠的預(yù)防功效，為麥胚球蛋白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 麥胚球蛋白，以脫脂麥胚為原料，按鹽提法提取制備，由河南省科譜特醫(yī)藥科技研究院有限公司提供，其中麥胚球蛋白≥1%。

亞硝酸鈉（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；維生素C（食品級(jí)），石藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司；總蛋白定量測(cè)定試劑盒（BCA）、蛋白定量測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、過(guò)氧化氫（CAT）試劑盒、抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所；其它試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)NO.41003100006969，許可證號(hào)SCXK 豫2017-0001），鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

基礎(chǔ)飼料配方：水分≤100 g，組氨酸≥5.5 g，鐵≥120 mg，維生素B1≥13 mg，粗蛋白≥200 g，色氨酸≥2.5 g，錳≥75 mg，維生素B2≥12 mg，粗脂肪≥40 g，苯丙+酪氨酸≥13.0 g，銅≥10 mg，維生素B6≥12 mg，粗纖維≤50 g，蘇氨酸≥8.8 g，鋅≥30 mg，煙酸≥60 mg，粗灰分≤80 g，亮氨酸≥17.6 g，碘≥0.3 mg，泛酸≥24 mg，鈣10～13 g，異亮氨酸≥10.3 g，硒≥0.1～0.2 mg，葉酸≥6.00 mg，總磷6～12 g，纈氨酸≥11.7 g，維生素A≥14 000 IU，生物素≥0.2 mg，賴(lài)氨酸≥13.2 mg，鎂≥2.0 mg，維生素D≤1 500 IU，維生素B12≥0.022 mg，蛋+胱氨酸≥7.8 g，鉀≥5.0 g，維生素E ≥120 IU，膽堿≥1 250 mg，精氨酸≥11.0 g，鈉≥2.0 g，維生素K≥5.0 g；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；XHF-D 高速分散器，寧波新生物股份有限公司；LT1002E 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；AU5800 全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)貝殼曼公司；Tecan Infinite pro 型號(hào)酶標(biāo)儀，瑞士帝肯有限公司；FMB-20 制冰機(jī)，杭州聚同電子有限公司；Dk-98-II 電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；723N 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 選取42 只體重（160～180 g）大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，參照文獻(xiàn)[13]，用隨機(jī)數(shù)字表法把大鼠分為空白組、模型組、麥胚球蛋白組（40 mg/kg）、麥胚球蛋白低劑量組（40 mg/kg）、麥胚球蛋白中劑量組（80 mg/kg）、麥胚球蛋白高劑量組（160 mg/kg） 以及維生素C組（80 mg/kg），每組6 只。末次給藥12 h 后，空白組和麥胚球蛋白組給予等體積的生理鹽水，其它各組按60 mg/kg NaNO2進(jìn)行灌胃，所有劑量都用去離子水配置。在最后一次治療24 h 后，用乙醚麻醉后處死大鼠。大鼠飼養(yǎng)于河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，整個(gè)試驗(yàn)期間，室溫控制在24～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光暗周期為12 h，動(dòng)物在整個(gè)治療期間均可自由飲食和水。

1.3.2 腎組織臟器系數(shù)測(cè)定 大鼠斷頸處死后立即解剖取出腎臟，用預(yù)冷生理鹽水清洗血液，濾紙吸干，稱(chēng)重并計(jì)算臟器系數(shù)。

腎臟系數(shù)（%）=腎臟質(zhì)量（mg）/體重（g）×100

1.3.3 血清生理生化指標(biāo)測(cè)定 將抗凝血3 000 r/min 離心10 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.3.4 腎組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定 腎組織當(dāng)中SOD、MDA、GSH、CAT、T-AOC 的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 Caspase 3 和Caspase 8 活力測(cè)定

取適量腎臟組織勻漿，其它均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 腎組織病理學(xué)檢查

大鼠處死后，迅速取腎組織置于4%多聚甲醛中固定，固定24 h 后用水沖洗，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯作透明劑，常規(guī)石蠟包埋處理后切成5 μm厚薄片，HE 染色，在×200 倍顯微鏡下觀察腎組織切片的形態(tài)變化。

2 數(shù)據(jù)處理

以上所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組試驗(yàn)保持3 個(gè)平行，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素（One-Way ANOVA）方差分析。P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽中毒大鼠腎質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響

麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎質(zhì)量及腎系數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表1，與空白組相比，亞硝酸鹽急性中毒會(huì)引起模型組大鼠腎重和腎臟系數(shù)升高 （P＜0.05），與之前報(bào)道一致[12]。經(jīng)麥胚球蛋白干預(yù)后，麥胚球蛋白各組腎重和腎臟系數(shù)分別降低（P＜0.05）。此外，麥胚球蛋白各組大鼠腎相對(duì)質(zhì)量和腎系數(shù)均與空白組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明麥胚球蛋白可以減輕亞硝酸鹽引起的腎損傷。

表1 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎質(zhì)量及腎系數(shù)的影響Table 1 Effects of WEG on kidney mass and their coefficients of rats

3.2 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽中毒大鼠腎功能的的影響

麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎功能指標(biāo)Cr 和BUN 的影響結(jié)果見(jiàn)圖1，與空白組相比，各麥胚球蛋白組以及維生素C 組中的BUN 和Cr 含量均未出現(xiàn)顯著差異。與模型組相比，BUN 和Cr 含量出現(xiàn)明顯降低，差異明顯（P＜0.05），說(shuō)明麥胚球蛋白能夠維持大鼠正常腎功能。

圖1 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎功的影響Fig.1 Effects of WEG on renal function of rats

3.3 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟抗氧化能力的影響

麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟抗氧能力影響如表2所示。與空白組相比，模型組大鼠腎臟中的SOD、CAT、T-AOC 和GSH 活性均低于空白組 （P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)充麥胚球蛋白和維生素C 以后可以明顯改善亞硝酸鹽急性中毒腎組織SOD、CAT、T-AOC 和GSH 含量，差異性顯著（P＜0.05），表明麥胚球蛋白可以清除體內(nèi)自由基，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

表2 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎組織抗氧化活性的影響Table 2 Effects of WEG on antioxidant activity of rats kidney

3.4 麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎組織中Caspase 3 和Caspase 8 的影響

麥胚球蛋白對(duì)大鼠腎臟Caspase 3 和Caspase 8 能力影響如表3所示。與空白組相比，模型組大鼠腎臟中Caspase 3 和Caspase 8 蛋白表達(dá)水平上升明顯（P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)充麥胚球蛋白以及維生素C 以后Caspase 3 和Caspase 8蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），表明麥胚球蛋白可能抑制腎臟上皮細(xì)胞凋亡，對(duì)亞硝酸鹽引起的腎組織氧化應(yīng)激具有減緩作用。

表3 麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎組織中Caspase 3 和Caspase 8 的影響Table 3 Effects of WEG on Caspase 3 and Caspase 8 of rats kidney

3.5 WEG 對(duì)大鼠腎組織的影響

大鼠腎組織切片HE 染色效果如圖2所示，與空白組相比，模型組大鼠腎組織中的腎小管?chē)?yán)重壞死，腎小管擴(kuò)張，管型形成，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而相比于模型組，麥胚球蛋白各組以及維生素C 組中大鼠腎小管壞死、管型形成、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均得到明顯緩解。

圖2 麥胚球蛋白對(duì)腎組織的影響（200×）Fig.2 The effect of WEG on the kidney （200×）

4 討論與結(jié)論

亞硝酸鹽作為食品添加劑用于維持或改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、味道和質(zhì)地，與胺反應(yīng)會(huì)生成亞硝胺和自由基，這些產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)人體器官造成損害。因此攝入一定量天然抗氧化劑可以預(yù)防器官炎癥損傷、控制相關(guān)疾病以及自由基的形成。本研究以麥胚球蛋白為研究對(duì)象，根據(jù)預(yù)設(shè)人均體重60 kg，每日應(yīng)攝入麥胚球蛋白40 mg/kg 的量，設(shè)置了3 個(gè)劑量，分別為40，80，160 mg/kg，進(jìn)行7 d喂養(yǎng)后進(jìn)行攻毒。亞硝酸鹽中毒劑量60 mg/kg 是參考以往文獻(xiàn)中毒劑量[12]，此劑量會(huì)造成大鼠中毒，但是不會(huì)造成大鼠死亡，本試驗(yàn)也用此劑量進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)證明。在整個(gè)灌胃麥胚球蛋白期間，各組大鼠發(fā)育良好，背毛濃密有光澤，活動(dòng)正常、較活躍，均未出現(xiàn)死亡和異?，F(xiàn)象。本文通過(guò)對(duì)大鼠的腎功能、抗氧化指標(biāo)以及細(xì)胞凋亡因子含量測(cè)定，初步探討得到麥胚球蛋白對(duì)亞硝酸鹽急性中毒大鼠腎損傷具有保護(hù)作用。

血清BUN 是指血液中除蛋白質(zhì)以外的含氮化合物，是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物，主要通過(guò)腎小球排出體外，當(dāng)腎小球?yàn)V率下降到正常值50%時(shí)，BUN 水平會(huì)迅速升高[14]。血清Cr 作為高能量化合物磷酸肌酸的分解物，由肌肉組織及神經(jīng)組織釋放至血液中，血液中的Cr 經(jīng)腎小球過(guò)濾后大部分不再被吸收，而是直接由尿液排出體外。血清中的Cr 濃度會(huì)因腎功能不全、尿毒癥等因素而上升，Cr 作為腎功能的檢測(cè)指標(biāo)在腎臟疾病的診斷及治療過(guò)程中具有重要意義[15]。所以血清BUN 和Cr 是臨床評(píng)價(jià)腎功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，當(dāng)腎功能受損時(shí)，BUN 和Cr 數(shù)值會(huì)明顯升高。以上結(jié)果說(shuō)明，麥胚球蛋白能緩解亞硝酸鹽導(dǎo)致的腎功能損傷。

當(dāng)亞硝酸鹽進(jìn)入機(jī)體時(shí)，會(huì)在代謝活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生大量自由基，如超氧陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫等，造成機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化和一些重要酶類(lèi)的氧化，從而導(dǎo)致機(jī)體器官組織損傷。T-AOC是評(píng)估體內(nèi)各類(lèi)抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同作用，對(duì)包括酶體系與非酶體系在內(nèi)的整個(gè)氧化防御酶系統(tǒng)做出宏觀評(píng)價(jià)的一個(gè)重要參考指標(biāo)[16]?？寡趸甘菣C(jī)體通過(guò)對(duì)氧化損傷防御的第一道防線(xiàn)，其中SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它具有特殊的生理活性，是清除自由基的主要酶[17]。SOD 可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化自由基造成的損傷，并修復(fù)自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。GSH 是一種廣泛存在于體內(nèi)的重要氧化物酶。GSH 的主要生物學(xué)功能是降低脂質(zhì)過(guò)氧化，迅速清除H2O2。CAT 是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的一部分，能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)椤H，使之分解為H2O 和氧氣[18]。MDA 是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，是將脂質(zhì)過(guò)氧化活性氧轉(zhuǎn)化為活性化學(xué)劑即非自由基質(zhì)分解產(chǎn)物，并通過(guò)鏈?zhǔn)交蛑ф湻磻?yīng)放大活性氧的氧化能力[19]，通常能反映體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化以及細(xì)胞損傷程度。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠腎組織中的MDA 水平顯著升高，同時(shí)T-AOC、SOD、GSH 以及CAT 顯著降低（P＜0.05），而經(jīng)麥胚球蛋白以及維生素C 干預(yù)后能顯著提高T-AOC、SOD、GSH 以及CAT 含量，且呈現(xiàn)一定程度劑量效應(yīng)的關(guān)系。以上試驗(yàn)結(jié)果表明麥胚球蛋白能夠提高機(jī)體抗氧化活力，清除氧自由基和預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化，降低氧化損傷程度。

細(xì)胞凋亡是急性亞硝酸鹽腎功能損傷的重要機(jī)制，而Caspase 家族是控制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)平衡的重要基因家族[20]。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)加速細(xì)胞凋亡，Caspase 3 和Caspase 8 不管在細(xì)胞外還是細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中均扮演重要的角色，因此本試驗(yàn)研究選擇Caspase 3 和Caspase 8 作為重要的檢測(cè)指標(biāo)。Caspase 3 是細(xì)胞凋亡途徑的最終凋亡因子，進(jìn)而激活細(xì)胞蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)發(fā)生降解失去活性，引起細(xì)胞凋亡[21]。Caspase 8 作為凋亡啟動(dòng)因子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心地位，可在其它蛋白輔助下，發(fā)生自我活化，最終誘發(fā)凋亡[22]。試驗(yàn)結(jié)果表明亞硝酸鹽急性中毒時(shí)麥胚球蛋白治療各組中的腎組織Caspase 3 和Caspase 8 的表達(dá)明顯低于模型組。兩部分試驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了麥胚球蛋白預(yù)防后的腎組織的凋亡率明顯低于模型組，麥胚球蛋白預(yù)防亞硝酸鹽所致的急性腎損傷的機(jī)制與減少組織細(xì)胞的凋亡保護(hù)有效腎細(xì)胞具有重要關(guān)系。與此同時(shí)，由病理切片可以看出，模型組大鼠腎組織中的腎小管?chē)?yán)重壞死，腎小管擴(kuò)張，管型形成，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而麥胚球蛋白以及維生素C 各組相比出現(xiàn)明顯改善，細(xì)胞腫脹減少，炎癥程度明顯減輕。病理切片與各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符合，進(jìn)一步說(shuō)明麥胚球蛋白在預(yù)防亞硝酸鹽對(duì)腎毒性損傷的可能性，為麥胚球蛋白的開(kāi)發(fā)提供新思路。

綜上所述，亞硝酸鹽攝入會(huì)導(dǎo)致大鼠腎組織損傷，引起脂質(zhì)代謝紊亂，降低機(jī)體抗氧化能力，對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷。麥胚球蛋白能夠改善亞硝酸鹽造成的腎組織氧化應(yīng)激能力，提高抗氧化能力，從而對(duì)大鼠腎組織具有一定保護(hù)作用。