營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響

王麗紅，楊 輝，耿涌喆，蘇 文，孔 陽(yáng)

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 西安 710021）

納米硒（SeNPs）具有抗氧化，調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)生長(zhǎng)，抗癌、抗菌等藥理作用，是一種新型的補(bǔ)硒形態(tài)[1-4]。微生物可通過同化還原、異化還原和生物群落甲基化等作用，將水體、底泥、土壤等環(huán)境中無機(jī)硒還原成SeNPs，積累在細(xì)胞內(nèi)或分泌在胞外[5]。微生物對(duì)納米硒的轉(zhuǎn)化具有普遍性，細(xì)菌、真菌、放線菌、原生動(dòng)物均能轉(zhuǎn)化合成SeNPs[6]，而且微生物合成的納米硒顆粒較物理、化學(xué)法合成的穩(wěn)定、分散性好[7-8]，具有成本低、毒性小、生物利用度高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。乳酸菌是一類可以調(diào)節(jié)生物體腸道內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對(duì)宿主消化、抗病、抗衰老等有促進(jìn)作用的微生物菌群，目前報(bào)道的可以轉(zhuǎn)化合成SeNPs 的有動(dòng)物雙歧桿菌[9]、保加利亞乳桿菌[10]、乳酸乳球菌[11]、干酪乳桿菌[12]、嗜酸乳桿菌[13]等。課題組前期研究分離到一株植物乳桿菌，對(duì)亞硒酸鈉耐受能力強(qiáng)、SeNPs 轉(zhuǎn)化率高，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

植物乳桿菌在生長(zhǎng)過程中需要的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)較復(fù)雜，一般采用的配方有MRS、M17、MC 等，在不同營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中植物乳桿菌生長(zhǎng)良好，并能將亞硒酸鈉還原成SeNPs。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，常用的植物乳桿菌營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)納米硒具有一定的還原性，在無植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖的情況下也可將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化合成SeNPs，對(duì)微生物還原合成納米硒有較大的干擾作用。目前有關(guān)常用營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)微生物合成納米硒的干擾情況還未見研究報(bào)道。本文通過研究合成培養(yǎng)基不同組分對(duì)亞硒酸鈉的還原情況，確定影響植物乳桿菌合成納米硒的主要成分，并進(jìn)一步采用改良培養(yǎng)基質(zhì)及菌體洗滌處理的方式，避免營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)植物乳桿菌合成納米硒的影響。本研究結(jié)果將為微生物合成納米硒及富硒菌的篩選及應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由陜西科技大學(xué)1C415 實(shí)驗(yàn)室分離保藏并鑒定。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

MRS 肉湯：葡萄糖20.0 g、牛肉膏5.0 g、硫酸錳0.05 g、蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸氫二鉀2.0 g、吐溫80 1 mL、檸檬酸三銨2.0 g、酵母菌粉4.0 g、蒸餾水1 000 mL，分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。

M17：酵母抽提液5.0 g、乳糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、葡萄糖2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、吐溫80 1 mL、乙酸鈉5.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.3，分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。

MC：葡萄糖20.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、乳糖20.0 g、酵母粉3.0 g、碳酸鈣10.0 g、中性紅0.05 g、牛肉浸粉3.0 g、pH 值6.0,分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。

亞硒酸鈉，山東西亞試劑有限公司；乳糖，成都金山化工試劑有限公司；蔗糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。其它試劑均為分析純級(jí)。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平，賽多利斯科技有限公司；生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；紫外-分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（EFI Verios460），美國(guó)；透射電子顯微鏡（H-7650），日本日立公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，重慶試驗(yàn)儀器設(shè)備廠；壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械有限公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-15D），北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.4 研究方法

1.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響 將活化3 次的植物乳桿菌分別以2%接種量接種于含亞硒酸鈉質(zhì)量濃度1 g/L 的MRS、M17、MC 液體培養(yǎng)基中，其中亞硒酸鈉需單獨(dú)滅菌后加入培養(yǎng)基中，35 ℃厭氧管培養(yǎng)，以相同條件未接種植物乳桿菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，48 h 后觀察發(fā)酵醪液中形成的納米硒的渾濁度及沉淀量，并測(cè)定亞硒酸鈉的還原率。

1.4.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同成分對(duì)納米硒的還原作用 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同組分即：葡萄糖20.0 g/L、牛肉膏5.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸錳0.05 g/L、蛋白胨10.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、吐溫80 1 mL/L、檸檬酸三銨2.0 g/L、酵母菌粉4.0 g/L、乳糖20.0 g/L、酵母抽提液5.0 g/L、牛肉浸粉3.0 g/L、碳酸鈣10.0 g/L 單獨(dú)配制滅菌，然后添加終質(zhì)量濃度為1 g/L 的亞硒酸鈉，48 h 后觀察紅色納米硒的形成情況。

將蔗糖20 g/L、磷酸緩沖液（pH 6.4）、0.9%生理鹽水、Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）單獨(dú)配制滅菌，然后添加終質(zhì)量濃度為1 g/L 的亞硒酸鈉，48 h 后觀察紅色納米硒的形成情況。

1.4.3 改良培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 將MRS培養(yǎng)基中葡萄糖換成蔗糖20 g/L，接種2%的植物乳桿菌35 ℃厭氧管培養(yǎng)24 h，以相同條件MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，采用比濁法，每隔2 h 取出1 mL菌液2 倍稀釋后600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察菌體生長(zhǎng)情況。

1.4.4 改良培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響 將植物乳桿菌分別以2%接種量接種于含亞硒酸鈉1，2，3，4，5，6 g/L 的改良蔗糖MRS 培養(yǎng)基中，35 ℃厭氧瓶培養(yǎng)，以相同條件MRS 培養(yǎng)基為對(duì)照，48 h 后觀察發(fā)酵醪液中形成的納米硒的紅色深淺度及亞硒酸鈉的還原率、富硒率。

1.4.5 改良培養(yǎng)方式對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響 將植物乳桿菌以2%接種量接種于MRS 厭氧瓶中，35 ℃培養(yǎng)11 h，取菌懸液各100 mL，4 000 r/min 離心10 min，分別采用Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）、0.9%生理鹽水、磷酸緩沖液（pH 6.4）洗滌3次并重懸于其中，然后添加終質(zhì)量濃度為1 g/L 的亞硒酸鈉，35 ℃厭氧瓶培養(yǎng)，48 h 后觀察發(fā)酵醪液中形成的納米硒的紅色深淺度及亞硒酸鈉的還原率。

1.4.6 納米硒轉(zhuǎn)化乳酸菌的表征

1）掃描電鏡（SEM）+能量分析光譜儀（EDX）觀察 將不同處理發(fā)酵醪液，高速冷凍離心機(jī)離心10 min （10 000 r/min，4 ℃），棄上清液收取沉淀，無菌水洗滌3 次離心得濕菌粉，在-20 ℃下預(yù)凍后凍干24 h，進(jìn)行SEM+EDX 分析。

2）透射電鏡觀察 （TEM） 將不同處理發(fā)酵醪液菌體離心洗滌后，用2.5%戊二醛-多聚甲酸固定液于4 ℃固定2 h，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液浸洗30 min；1%四氧化鋨固定液于4 ℃固定2 h，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液浸洗10 min；依次用30%，50%，70%，90%乙醇，無水乙醇脫水；用包埋劑（Epon812-丙酮1∶1）于37 ℃浸泡2 h，再用包埋劑60℃浸泡0.5～1 h；37 ℃聚合12 h，超薄切片50～70 nm；用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色各10 min 后進(jìn)行。

1.4.7 數(shù)據(jù)測(cè)定與處理

1）亞硒酸鈉還原率及富硒率 亞硒酸鈉濃度測(cè)定采用比色法[14]

富硒率=亞硒酸鈉還原率×加硒量

2）數(shù)據(jù)處理 采用Origin Pro8.5 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響

MRS、M17、MC 為常見乳酸菌的培養(yǎng)基，研究接種植物乳桿菌的不同培養(yǎng)基對(duì)納米硒合成影響，并以未接菌的含等量亞硒酸納的培養(yǎng)基為對(duì)照，72 h 后觀察發(fā)酵醪液渾濁度及沉淀物的量，并測(cè)定亞硒酸鈉的還原率，結(jié)果如表1。

微生物在生長(zhǎng)繁殖過程中會(huì)還原亞硒酸鹽，產(chǎn)生典型的紅色懸浮狀納米硒顆粒，使發(fā)酵液渾濁，并且隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌體下沉，部分紅色顆粒會(huì)沉淀于管底。從表1中可以看出，不同培養(yǎng)基在不加菌的情況下對(duì)亞硒酸鈉均有還原性，引起發(fā)酵液的渾濁，形成紅色納米硒沉淀。其中MRS 培養(yǎng)基中形成的紅色沉淀較多，其次為MC，M17 培養(yǎng)中產(chǎn)生沉淀最少，同時(shí)觀察MC 培養(yǎng)基中出現(xiàn)了較多的絮狀沉淀，可能是蛋白質(zhì)產(chǎn)生了絮凝現(xiàn)象，因此，推測(cè)3 種培養(yǎng)基中均有能將亞硒酸鈉還原的物質(zhì)，對(duì)比不同培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)情況及亞硒酸鈉的還原率，相同條件下接種植物乳桿菌的發(fā)酵液中亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率較高，說明菌體本身也能轉(zhuǎn)化合成納米硒，但培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化能力也較強(qiáng)，因此對(duì)研究植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成的納米硒有較大干擾作用。在有機(jī)硒、納米硒的微生物轉(zhuǎn)化合成研究中，有關(guān)培養(yǎng)基對(duì)亞硒酸鈉的還原作用一直被忽視[11-13，15]，楊靖鵬等[16]采用MRS 的培養(yǎng)基篩選富硒乳酸菌，在富硒后的菌體表面觀察到了納米硒顆粒，但不能排除培養(yǎng)基本身的干擾。

表1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液顏色及亞硒酸鈉的還原率Table 1 Color of fermentation broth and reduction rate of sodium selenite in different media

3 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中MRS 是植物乳桿菌生長(zhǎng)的最適營(yíng)養(yǎng)，相比轉(zhuǎn)化率最高，顯微鏡1 000 倍觀察MRS 無菌和有菌情況下結(jié)果如圖1，從圖中可知未接菌的MRS 培養(yǎng)中大量游離的顆粒，有菌的培養(yǎng)基中菌體周圍也有較多的顆粒，兩種情況下培養(yǎng)基均呈現(xiàn)紅色渾濁狀態(tài)，因此難以區(qū)別納米硒是由菌體合成的還是由基質(zhì)還原形成的。

圖1 MRS 培養(yǎng)液中納米硒顯微鏡觀察（1 000×）Fig.1 Microscopic observation of nano-selenium in MRS culture medium （1 000×）

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同成分對(duì)納米硒的還原作用

通過對(duì)比基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同組分對(duì)亞硒酸鈉的還原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖、乳糖組分中出現(xiàn)紅色渾濁，葡萄糖的紅色物質(zhì)較乳糖多，其它組分未發(fā)現(xiàn)形成紅色物質(zhì)，說明葡萄糖、乳糖是干擾菌體轉(zhuǎn)化合成納米硒的主要因素。葡萄糖、乳糖屬于還原性糖，葡萄糖的結(jié)構(gòu)式中含有5 個(gè)羥基和1 個(gè)醛基，乳糖是由葡萄糖和半乳糖縮合而成的二糖，分子都含有醛基，醛基具有還原性，乳糖結(jié)構(gòu)中只有葡萄糖保留還原性，因而相同濃度下還原性稍弱，但都可將亞硒酸鈉還原為單質(zhì)硒，醛基自身則被氧化為羧基。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乳糖在高溫滅菌前對(duì)亞硒酸鈉還原性較弱，需要放置96 h 后才能有少量納米硒形成，但高溫滅菌后乳糖水溶液顏色變黃，對(duì)納米硒還原性增強(qiáng)，可能是高溫加熱使乳糖水溶液發(fā)生了部分水解，產(chǎn)生了少量的葡萄糖和半乳糖，二者均具有還原性，因而對(duì)亞硒酸鈉還原能力增強(qiáng)。

張波等[17]采用水熱合成法合成了納米硒，認(rèn)為是木質(zhì)素將二氧化硒還原成納米硒，但反應(yīng)過程中添加了大量葡萄糖，很難說明不是葡萄糖的還原作用。而且葡萄糖、乳糖是很多微生物培養(yǎng)基常添加的碳源物質(zhì)，因此在研究富硒微生物或納米硒轉(zhuǎn)化菌篩選中，如果基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有葡萄糖、乳糖，就不能排除培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)菌體富硒能力的影響。目前，在微生物還原形成有機(jī)硒、納米硒的報(bào)道中[9，18-19]，排除培養(yǎng)基中葡萄糖、乳糖還原作用的相關(guān)文獻(xiàn)還未見報(bào)道，因此研究改良培養(yǎng)基對(duì)微生物富硒的研究具有重要意義。

將蔗糖20 g/L、蔗糖改良MRS、磷酸緩沖液、0.9%生理鹽水、Tris-HCL 緩沖液?jiǎn)为?dú)滅菌后添加亞硒酸鈉，發(fā)現(xiàn)均不能將亞硒酸鈉還原，因此可用于后續(xù)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成納米硒的研究。

2.3 改良培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖組成，不含有游離醛基，因而沒有還原性，而且蔗糖易于被微生物分解利用，屬于速效碳源。試驗(yàn)通過將MRS 中葡萄糖替換成等量蔗糖，對(duì)比其對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2。

從圖2中可以看出，MRS 培養(yǎng)基和改良的蔗糖培養(yǎng)基均能滿足菌體的快速增長(zhǎng)，在2 h 后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，12 h 后基本達(dá)到穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)快速。但MRS 相比可以有效縮短延滯期，在前8 h生長(zhǎng)繁殖較旺盛，而改良培養(yǎng)基在8 h 后也達(dá)到了相同的濁度，說明改良培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)沒有明顯影響，可代替MRS 用于植物乳桿菌的培養(yǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)基中植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Lactobacillus plantarum in different media

2.4 亞硒酸鈉濃度及改良培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響

微生物對(duì)基質(zhì)中亞硒酸鹽的還原，被認(rèn)為是菌體的脫毒作用，菌體內(nèi)谷胱甘肽首先提供電子轉(zhuǎn)化亞硒酸鹽形成硒代谷胱甘肽（GS-Se-SG），然后經(jīng)谷胱甘肽還原酶或硫氧還蛋白還原酶進(jìn)一步還原，形成不穩(wěn)定谷胱甘肽硒硫化物（GS-Se-），后經(jīng)水解形成還原型谷胱甘肽GSH 和單質(zhì)硒[20]，再通過硒因子A（Sef A）分泌到胞外[21]。研究表明植物乳桿菌對(duì)亞硒酸鈉的耐受能力較強(qiáng)，并在生長(zhǎng)繁殖過程中可通過解毒作用轉(zhuǎn)化合成的納米硒，采用改良MRS 培養(yǎng)基研究不同亞硒酸鈉濃度下納米硒的轉(zhuǎn)化，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)：不同濃度下發(fā)酵液均出現(xiàn)紅色納米硒，亞硒酸鈉為1～4 g/L 時(shí)發(fā)酵液呈紅色乳濁液，并且底部較多沉淀，但隨著亞硒酸鈉濃度增大，發(fā)酵液開始變澄清，沉淀物減少，說明菌體生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。亞硒酸鈉的還原率及植物乳桿菌的富硒率測(cè)定如圖3。

從圖3可知亞硒酸鈉濃度較低時(shí)，植物乳桿菌轉(zhuǎn)化率最大，隨著亞硒酸鈉濃度的增加還原率下降，說明亞硒酸鈉對(duì)菌體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了一定抑制，但從植物乳桿菌的富硒總收率來考慮，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為4 g/L，收率達(dá)到1.3 g/L，因此如果優(yōu)先考慮菌體活力可采用較低濃度的亞硒酸鈉，但高濃度亞硒酸鈉可增加植物乳桿菌的富硒率，合成較多的納米硒。

圖3 不同亞硒酸鈉濃度對(duì)植物乳桿菌富硒影響Fig.3 The effect of sodium selenite concentrations on selenium enrichment of Lactobacillus plantarum

顯微鏡下觀察發(fā)酵液，MRS 培養(yǎng)液中大量納米硒顆粒懸浮，而改良MRS 中懸浮顆粒較少，大部分顆粒黏附于細(xì)胞表面，由胞內(nèi)逐漸分泌到胞外。進(jìn)一步觀察掃描電鏡如圖4，從圖中可知MRS培養(yǎng)基合成的納米顆粒較多，聚集排列，一些顆粒黏附在一起，顆粒大小不一。而改良MRS 形成的納米硒顆粒分布在菌體的周圍，分散性較好，顆粒均勻，由此可見植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成的納米顆粒更穩(wěn)定，Butler 等[21]研究表明在納米硒的表面包覆著蛋白質(zhì)，為納米硒合成提供反應(yīng)位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)納米硒的穩(wěn)定起重要作用，防止其聚集長(zhǎng)大。植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成的納米硒分散性好，可能也是因?yàn)榫w在繁殖過程中合成的蛋白質(zhì)的作用，而化學(xué)合成一般需要加入模板維持納米顆粒的穩(wěn)定[22]，因此在MRS 培養(yǎng)基沒有加入穩(wěn)定分散劑，故納米硒容易聚合形成不穩(wěn)定的顆粒。

圖4 不同培養(yǎng)基植物乳桿菌合成納米硒電鏡圖Fig.4 Electron microscope image of nano-selenium by Lactobacillus plantarum in different media

對(duì)改良MRS 培養(yǎng)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒進(jìn)行能譜分析，結(jié)果如圖5所示，表明在選定區(qū)域主要成分為菌體自身的C、N、O 和硒，因此說明球形顆粒為納米硒，有些顆粒還黏附在菌體的表面，納米硒表面可能被蛋白質(zhì)等物質(zhì)包覆，同時(shí)可見分泌納米硒的細(xì)胞表面凹凸不平，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一些變化，說明細(xì)胞在解毒合成納米硒的過程中對(duì)菌體自身產(chǎn)生了一定的毒性。

圖5 改良MRS 培養(yǎng)植物乳桿菌合成納米硒能譜圖Fig.5 Energy spectrum of selenium nanoparticles synthesized by Lactobacillus plantarum cultured by modified MRS

2.5 改良培養(yǎng)方式對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的影響

目前，利用微生物轉(zhuǎn)化合成納米硒主要都是在菌體生長(zhǎng)過程中形成，但培養(yǎng)基中成分較復(fù)雜，而且隨著細(xì)胞的代謝利用，培養(yǎng)基的組分還處于不斷變化中，因此對(duì)于研究微生物轉(zhuǎn)化合成納米硒的機(jī)理有較大干擾，因此試驗(yàn)通過改良培養(yǎng)方式，采用對(duì)數(shù)期的植物乳桿菌接種到Tris-HCl 緩沖液、生理鹽水、磷酸緩沖液中，研究無營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒，為后續(xù)合成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可避免亞硒酸鈉對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用。

首先采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將菌體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)后期11 h，然后離心洗滌后重懸于含有亞硒酸鈉的Tris-HCl 緩沖液、生理鹽水、磷酸緩沖液，觀察結(jié)果如圖6所示，磷酸緩沖液中植物乳桿菌將亞硒酸鈉還原，形成紅色納米硒，亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率7.1%。Tris-HCl 緩沖液、生理鹽水中沒有納米硒顆粒形成。Tugarova 等[23]發(fā)現(xiàn)生理鹽水可促進(jìn)巴西偶氮螺菌轉(zhuǎn)化合成納米硒，徐穎等[24]報(bào)道鹽脅迫可以促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的富硒作用，但生理鹽水對(duì)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒沒有作用。磷酸緩沖液可以明顯促進(jìn)植物乳桿菌對(duì)亞硒酸鈉的還原，可能與亞硒酸鹽在菌體內(nèi)的還原機(jī)理有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)不同的酶系統(tǒng)參與了亞硒酸鹽在細(xì)菌中的還原和SeNPs 的產(chǎn)生，NADH 或NADPH 為電子供體[25]，磷酸緩沖液能夠促進(jìn)電子供體的形成，因此有利于用植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成納米硒。

圖6 不同溶液合成納米硒顏色比較Fig.6 Color comparison of nano selenium synthesized by different solutions

圖7 植物乳桿菌合成納米硒透射電鏡圖Fig.7 TEM of selenium nanoparticles synthesized by Lactobacillus plantarum

由透射電鏡圖可以看出，在菌體內(nèi)散布著微小的納米硒顆粒，說明納米硒在菌體內(nèi)被合成，部分被分泌在胞外，個(gè)別顆粒還留在胞內(nèi)，因而菌體和培養(yǎng)液呈現(xiàn)納米硒的紅色，后續(xù)可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究植物乳桿菌轉(zhuǎn)化納米硒的機(jī)理。

3 結(jié)論

1）在納米硒微生物合成和富硒菌的研究中，培養(yǎng)基中葡萄糖、乳糖及一些還原性糖可將亞硒酸鈉還原成單質(zhì)硒，影響菌體自身納米硒的轉(zhuǎn)化。

2）采用蔗糖改良MRS 培養(yǎng)基可避免營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中還原性糖的干擾，適合植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖，合成的納米顆粒分散性好、均勻、穩(wěn)定，并且亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為4 g/L 時(shí)富硒率較高。

3）將植物乳桿菌洗滌后接種于磷酸緩沖液中，可促進(jìn)亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化合成納米硒，說明磷酸根離子參與了納米硒的合成，有關(guān)植物乳桿菌合成納米硒的機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。