均相時(shí)間分辨熒光法測(cè)定阿達(dá)木單抗結(jié)合活性

鄧春平，陳航，謝建華，劉翠華

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在炎癥反應(yīng)中起重要作用。TNF-α 主要由活化的單核巨噬細(xì)胞合成、分泌；反過(guò)來(lái)又以自分泌和旁分泌的方式激活單核巨噬細(xì)胞，使其釋放大量 IL-1、IL-6、IL-8、PGE2 等炎性介質(zhì)，激發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)[1-2]。阿達(dá)木單抗系由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的重組全人源抗 TNF-α 單克隆抗體，可以拮抗 TNF-α 與靶細(xì)胞膜上受體的結(jié)合，終止或者減弱炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，這對(duì)治療 TNF-α 引起的炎癥反應(yīng)等相關(guān)疾病具有重要意義[3-5]。作為治療性抗體，其與抗原的結(jié)合活性是反映其作用機(jī)制和藥效學(xué)的重要指標(biāo)，是該類(lèi)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性[6-7]。目前，抗體結(jié)合活性常用方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[6-9]，但此方法操作過(guò)程較繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定方法以滿(mǎn)足細(xì)胞克隆篩選、生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量研究、放行檢測(cè)及穩(wěn)定性研究等需求非常有意義。

均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種可用于檢測(cè)純液相體系中受體與配體結(jié)合的新技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了時(shí)間分辨熒光（time-resolved fluorescence，TRF）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）兩種技術(shù)。TRF 技術(shù)利用了稀土元素中鑭系元素的獨(dú)特性質(zhì)，其比傳統(tǒng)熒光基團(tuán)具有更大的斯托克斯位移和更長(zhǎng)的發(fā)射半衰期；通過(guò)設(shè)定適當(dāng)?shù)难舆t和門(mén)控時(shí)間，以激發(fā)光激發(fā)待測(cè)產(chǎn)物，短半衰期的背景熒光信號(hào)會(huì)在延遲時(shí)間內(nèi)衰減及消失，而后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行采集，可獲得長(zhǎng)半衰期的熒光信號(hào)，再根據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。TRF 技術(shù)可有效降低背景短半衰期熒光的干擾，提高檢測(cè)靈敏度[10-11]；常用的鑭系元素有銪（Eu）和鋱（Tb）。FRET 是指電子激發(fā)能在適當(dāng)?shù)哪芰抗w與能量受體之間進(jìn)行傳遞。當(dāng)一個(gè)供體熒光團(tuán)和一個(gè)受體熒光團(tuán)距離足夠近時(shí)（激發(fā)光譜相重疊時(shí)），光子能從受激發(fā)的供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)，從而激發(fā)受體熒光團(tuán)使其發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)供體熒光團(tuán)自身的熒光強(qiáng)度發(fā)生衰減；供體熒光團(tuán)與受體熒光團(tuán)分別標(biāo)記可發(fā)生相互作用的兩個(gè)生物分子，當(dāng)兩個(gè)生物分子發(fā)生結(jié)合時(shí)，可以將能量供體和受體拉到足夠近的距離，從而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移[11-12]。由于受體熒光團(tuán)的發(fā)射光來(lái)自于能量轉(zhuǎn)移，因此檢測(cè)過(guò)程無(wú)需將未結(jié)合與已結(jié)合的生物分子分開(kāi)，即無(wú)洗滌或分離步驟，整個(gè)反應(yīng)在均相（液相）中進(jìn)行，可減少實(shí)驗(yàn)操作步驟。HTRF 技術(shù)的能量供體是鑭系元素（如 Eu 或Tb），能量受體主要有別藻藍(lán)蛋白（APC）和小分子熒光探針 d2。HTRF 技術(shù)將 FRET 的均相實(shí)驗(yàn)方式與 TRF 的低背景高靈敏度特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，使得 HTRF 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈活、通量高、耗量少、靈敏度高、假陽(yáng)性率較低等優(yōu)勢(shì)[11-14]。本研究旨在基于 HTRF 技術(shù)，建立一種新的、快速、簡(jiǎn)便測(cè)定阿達(dá)木單抗與 TNF-α 抗原結(jié)合活性的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Infinite F200 多功能酶標(biāo)儀為瑞士Tecan 公司產(chǎn)品；SpectraMax M4 酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Device 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑與樣品 Eu3+-anti-human IgG(Fc)購(gòu)自美國(guó) PerkinElmer 公司；Lightning-Link APC Kit 購(gòu)自英國(guó) Innova 公司；TNF-α 購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗人 IgG(Fc) 抗體和 Human IgG 購(gòu)自美國(guó) Jackson Immuno Research 公司；脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó) Becton Dickinson 公司；TMB 顯色液購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；96 孔酶標(biāo)板及不透明黑板為美國(guó) Costar 公司產(chǎn)品；利妥昔單抗和曲妥珠單抗均購(gòu)自瑞士 Roche 公司；戈利木單抗購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；阿達(dá)木單抗注射液樣品及內(nèi)部活性標(biāo)準(zhǔn)品均由百奧泰生物制藥股份有限公司制備和保存。

1.2 方法

1.2.1 TNF-α-APC XL的標(biāo)記 依照Lightning-Link APC Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。1 μl LL-modifier reagent 加至 10 μl 濃度為 1 mg/ml的 TNF-α 溶液中，混合均勻；將此混合液轉(zhuǎn)移至Lightning-Link mix 中，混勻；室溫下孵育 5 h；隨后加入 1 μl LL-quencher reagent，混勻；室溫孵育0.5 h 即標(biāo)記完成。

1.2.2 HTRF 法檢測(cè)步驟 用 PBST（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，0.05% Tween 20，pH 7.3）將阿達(dá)木單抗標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品稀釋至 1100 ng/ml，而后以 1:1.7 倍比例進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)驳玫?11 個(gè)濃度梯度（900、529.4、311.4、183.2、107.8、63.4、37.3、21.9、12.9、7.6 和 4.5 ng/ml）；在 96 孔不透明黑板中，以 50 μl/孔加入 200 ng/ml 的Eu3+-anti-human IgG(Fc)，而后以 50 μl/孔加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品溶液，空白對(duì)照孔中加入 PBST。96 孔板于 25 ℃ 振蕩孵育 1 h；再以 50 μl/孔加入 200 ng/ml TNF-α-APC XL，于25 ℃ 振蕩孵育 1 h 后于 Infinite F200 多功能酶標(biāo)儀上讀取熒光信號(hào)值，酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，在發(fā)射波長(zhǎng) 620 nm 和 665 nm 處讀取熒光值；采用 Magellan 7.0 軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品或樣品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng) ΔF = {[（F665/F620）sample-（F665/F620）blank]/（F665/F620）blank}× 100 值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合，繪制抗體濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)，其中擬合的四參數(shù)方程的 C 值即為半數(shù)有效濃度（EC50），樣品相對(duì)結(jié)合活性 = 活性標(biāo)準(zhǔn)品 EC50/樣品 EC50× 100%。

1.2.3 HTRF 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1 專(zhuān)屬性 分別制備抗 CD20 單抗（利妥昔單抗），抗 HER2 單抗（曲妥珠單抗），抗 TNF-α單抗（阿達(dá)木單抗和戈利木單抗）及 Human IgG 梯度稀釋樣品溶液，按檢測(cè)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察各單抗或 IgG 是否與 TNF-α 結(jié)合。

1.2.3.2 準(zhǔn)確性 制備不同活性水平的阿達(dá)木單抗溶液，50%、75%、100%、125%、150%（其對(duì)應(yīng)的濃度分別為 550、825、1100、1375 和1650 ng/ml），每個(gè)活性水平進(jìn)行 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同活性水平樣品的實(shí)測(cè)值，計(jì)算回收率。

1.2.3.3 精密度 制備 100% 相對(duì)活性的阿達(dá)木單抗溶液（其對(duì)應(yīng)的濃度為 1100 ng/ml），同一名分析人員在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)檢測(cè) 6 次，測(cè)定相對(duì)結(jié)合活性并計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），此為重復(fù)性；兩名分析人員對(duì)上述 100% 相對(duì)活性的阿達(dá)木單抗溶液在相同試驗(yàn)條件下分別重復(fù)檢測(cè) 6 次，測(cè)定相對(duì)結(jié)合活性并計(jì)算兩名分析人員 12 次測(cè)定結(jié)果的 CV，此為不同分析人員之間精密度。

1.2.3.4 線(xiàn)性與范圍 根據(jù)準(zhǔn)確性結(jié)果，以不同理論相對(duì)活性為橫坐標(biāo)，以實(shí)際測(cè)得的相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性擬合；根據(jù)準(zhǔn)確性、精密度和線(xiàn)性的結(jié)果確定方法測(cè)定的有效范圍。

1.2.3.5 穩(wěn)定性指示能力 采用制劑緩沖液將阿達(dá)木單抗預(yù)先稀釋至 1 mg/ml，而后在 70 ℃ 加熱0、5、10、30、60 min，以阿達(dá)木單抗內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品為參比品，檢測(cè)不同加熱時(shí)間處理的樣品的相對(duì)結(jié)合活性。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)步驟 TNF-α 經(jīng)稀釋后加入 96 孔酶標(biāo)板，4 ℃ 包被過(guò)夜；經(jīng)脫脂牛奶封閉，于 37 ℃ 孵育 1 h；將阿達(dá)木單抗標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品稀釋至適當(dāng)濃度，而后以 1:2.5 倍比例梯度稀釋?zhuān)驳玫?12 個(gè)濃度梯度；混勻后加入 96 孔板，37 ℃ 溫育 2 h；洗滌后用加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗人 IgG(Fc) 抗體，于 37 ℃ 孵育 1 h，洗滌后加入顯色液，37 ℃ 避光顯色約 20 min 后，加入硫酸終止。用酶標(biāo)儀于 450 nm 處讀取吸光度值（A450）。采用 SoftMax Pro 6.5 軟件，以活性標(biāo)準(zhǔn)品或樣品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合，繪制抗體濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)，其中擬合的四參數(shù)方程的 C 值即為半數(shù)有效濃度（EC50），樣品相對(duì)結(jié)合活性 = 活性標(biāo)準(zhǔn)品 EC50/樣品 EC50× 100%。

1.2.5 HTRF 法與 ELISA 法的比較 采用建立的 HTRF 法與本單位已建立的 ELISA 法分別對(duì)同一批阿達(dá)木單抗注射液重復(fù)檢測(cè) 10 次，或同時(shí)檢測(cè) 10 批阿達(dá)木單抗注射液，采用 SPSS 13.0軟件分析兩種方法所得結(jié)果的差異。

2 結(jié)果

2.1 HTRF 法擬合曲線(xiàn)

根據(jù)方法開(kāi)發(fā)確定的檢測(cè)步驟得到的劑量-效應(yīng)擬合曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，阿達(dá)木單抗與TNF-α 的結(jié)合顯示出明顯的濃度依賴(lài)性，并呈現(xiàn)典型的“S”型濃度-效應(yīng)曲線(xiàn)，有明顯的上下平臺(tái)。

圖1 HTRF法的四參數(shù)擬合曲線(xiàn)Figure 1 Fitting curve with four-parameters logistic model for HTRF method

2.2 HTRF 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性 圖2 的結(jié)果顯示，檢測(cè)試劑TNF-α 只與阿達(dá)木單抗及戈利木單抗結(jié)合，并呈濃度依賴(lài)性，不與抗 CD20 單抗、抗 HER2 單抗及Human IgG 結(jié)合，說(shuō)明本法對(duì)抗 TNF-α 單抗具有專(zhuān)屬特異性。

圖2 HTRF 方法的專(zhuān)屬性Figure 2 The specificity of the HTRF method

2.2.2 準(zhǔn)確性 方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果（表1）顯示，不同活性水平單次測(cè)定結(jié)果的回收率在88.5% ～ 110.4% 之間，平均回收率在 92.5% ～104.8% 之間，均處于 80% ～ 120% 之間，且 3 次重復(fù)結(jié)果的 CV≤ 10%，本法的準(zhǔn)確性符合要求。

表1 HTRF 方法的準(zhǔn)確性Table 1 The accuracy of the HTRF method

2.2.3 精密度 兩名分析人員重復(fù) 6 次結(jié)果的CV分別為 8.7% 和 10.7%，總體為 10.1%，均不超過(guò) 15%（表2），本法的精密度符合要求。

表2 HTRF 方法的精密度Table 2 The precision of the HTRF method

2.2.4 線(xiàn)性與范圍 理論相對(duì)活性與實(shí)際測(cè)得的相對(duì)活性線(xiàn)性擬合圖見(jiàn)圖3，線(xiàn)性方程 y = 1.058x- 6.44，線(xiàn)性方程的斜率 1.058，相關(guān)系數(shù)r2=0.9945；線(xiàn)性方程的斜率在 0.85 ～ 1.15 之間，相關(guān)系數(shù)r2≥ 0.95，本法的線(xiàn)性符合要求。根據(jù)準(zhǔn)確性、精密度和線(xiàn)性的結(jié)果，本法測(cè)定的范圍為 50% ～150%。

圖3 HTRF 方法的線(xiàn)性Figure 3 The linearity of the HTRF method

2.2.5 穩(wěn)定性指示能力 阿達(dá)木單抗經(jīng)高溫加熱5、10、30、60 min，其相對(duì)活性由未加熱處理的102% 分別下降到 95%、91%、82%、71%，隨加熱時(shí)間呈明顯下降趨勢(shì)，表明本法可反映阿達(dá)木單抗的穩(wěn)定性，具有穩(wěn)定性指示能力。

2.2.6 HTRF 法與 ELISA 法測(cè)定結(jié)果的比較 采用 HTRF 法與 ELISA 法分別對(duì)同一批阿達(dá)木單抗注射液重復(fù)檢測(cè) 10 次；結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)得的結(jié)果基本一致（表3），采用 SPSS13.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)，兩組結(jié)果沒(méi)有顯著差異（P= 0.600）。采用兩種方法同時(shí)檢測(cè) 10 批阿達(dá)木單抗注射液，結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)得的結(jié)果也表現(xiàn)一致（表4），采用 SPSS13.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)，兩組結(jié)果沒(méi)有顯著差異（P= 0.518）。

表3 HTRF 與 ELISA 法測(cè)定同一批樣品的結(jié)果比較Table 3 The comparison of HTRF and ELISA results by testing one sample batch

表4 HTRF 與 ELISA 法測(cè)定 10 批樣品的結(jié)果比較Table 4 The comparison of HTRF and ELISA results by testing 10 sample batch

3 討論

治療類(lèi)重組單克隆抗體與其靶點(diǎn)抗原的結(jié)合能力是抗體發(fā)揮生物學(xué)功能的首要條件。因此，抗體與抗原結(jié)合活性的測(cè)定是反映產(chǎn)品特定生物學(xué)效應(yīng)的重要指標(biāo)[6-7]，同時(shí)可在一定程度上反映單抗分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的正確性，也可以反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的批間一致性。目前一般采用 ELISA 法測(cè)定抗體與抗原的結(jié)合活性，此方法需包板、洗滌等諸多步驟，操作較繁瑣費(fèi)時(shí)，變異性也較大。本研究采用的 HTRF 法使用的能量供體鑭系元素 Eu 是與一種絡(luò)合的穴狀化合物結(jié)合，這種結(jié)合的穴狀物非常穩(wěn)定，可耐受高溫、低 pH、螯合物、金屬離子、DMSO 等[11,15-16]。此技術(shù)已應(yīng)用于生物分子之間相互作用研究[17]、細(xì)胞信號(hào)通路研究[18]、藥物篩選[19-20]、含量測(cè)定[11]、活性測(cè)定[12]等方面。

HTRF 法用于重組單抗的抗原結(jié)合活性測(cè)定時(shí)，只需用受體熒光團(tuán)標(biāo)記其對(duì)應(yīng)的抗原，將抗體、標(biāo)記的抗原及供體熒光團(tuán)（如 Eu）標(biāo)記的抗人IgG(Fc) 加入 96 孔板中孵育一定時(shí)間后即可檢測(cè)。該方法操作步驟非常簡(jiǎn)單，不需要提前包被、封閉和洗板等操作，可極大縮短檢測(cè)時(shí)間[11]；同時(shí)，由于簡(jiǎn)化了操作步驟，也降低了方法的變異性，提高了精密度。此外，由于反應(yīng)是在溶液均相中進(jìn)行，不存在包被固定，清洗等過(guò)程，可以很大程度反映抗原與抗體在溶液中的實(shí)際結(jié)合情況。本研究建立的 HTRF 法測(cè)定阿達(dá)木單抗與 TNF-α 抗原的結(jié)合活性，專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確性、精密度和線(xiàn)性均滿(mǎn)足要求，檢測(cè)范圍較寬；同時(shí)可檢測(cè)加熱破壞的阿達(dá)木單抗的活性變化情況，反映單抗的穩(wěn)定性，具有穩(wěn)定性指示能力；此外，本法與本單位建立并經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的常規(guī) ELISA 法也進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，兩種方法的測(cè)定結(jié)果等效。本研究建立的HTRF 法可用于阿達(dá)木單抗與 TNF-α 結(jié)合活性的測(cè)定，也可為其他抗體藥物的結(jié)合活性檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供參考。