L-肉堿對草龜脂肪代謝的影響

武 帆， 楊振才

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024）

L-肉堿即左旋肉堿，化學(xué)名為β-羥基-γ-三甲銨丁酸， 分子式C7H15NO3， 相對分子質(zhì)量為161.20，是一種多功能有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，被命名為維生素BT，在脂肪酸的β-氧化中發(fā)揮著重要作用，是運(yùn)輸長鏈脂肪酸的重要載體（楊月英等，2015）。在生物體中，L-肉堿可由必需氨基酸賴氨酸和蛋氨酸在維生素C 和其他次生化合物的存在下自然合成（Geng 等，2019），這種在生物體內(nèi)自然合成的肉堿被稱為內(nèi)源性L-肉堿。高密度養(yǎng)殖可能會導(dǎo)致動物合成內(nèi)源性L-肉堿的能力降低，使其不能滿足動物體生長代謝的基本需求， 影響動物體的正常生理功能（Li 等，2019）。 缺乏 L-肉堿一般會使動物出現(xiàn)生長緩慢、 脂類代謝紊亂和脂肪肝等問題（王朕朕等，2012），因此需要在飼料中添加外源性L-肉堿。

有關(guān)L-肉堿對水產(chǎn)動物脂肪代謝影響方面的研究主要集中在魚類， 而且對不同動物的研究結(jié)果并不一致。 Li 等（2019）發(fā)現(xiàn)，添加外源性L-肉堿可增強(qiáng)線粒體β 氧化活性和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1 mRNA 的表達(dá)。 Ozório 等（2012）研究表明，在飼料中添加L-肉堿降低了虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟中游離脂肪酸的含量，表明脂肪酸利用率的增加。董婧（2014）以鯉魚（Cyprinus carpio）幼魚為研究對象， 在其飼料中添加150 mg/kg 的L-肉堿，可顯著提高鯉魚肝臟中總脂酶、脂蛋白脂酶、肝脂酶和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1 的活性，這表明適量外源肉堿的添加可使脂肪酸代謝增強(qiáng)。 而Dias 等（2001）在飼料中添加L-肉堿后，并未對歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）血漿甘油三酯和膽固醇水平以及組織脂質(zhì)含量造成顯著影響。Selcuk 等（2010）在虹鱒的飼料中添加L-肉堿后也未對脂肪代謝有促進(jìn)作用。影響L-肉堿作用效果的原因可能與飼料中不同脂肪的來源和含量（王立新等，2005）、飼料的能量蛋白比等有關(guān)。 這些因素之間的相互作用可能影響了L-肉堿對魚體脂肪的調(diào)節(jié)作用。 據(jù)推測， 所有相互作用都可能通過影響脂肪酸β-氧化過程中參與的酶的活性來調(diào)節(jié)L-肉堿在脂代謝中的作用 （Zheng 等，2014）。

草龜是雜食性次生水生爬行動物， 運(yùn)動能力弱、耐饑餓能力強(qiáng)，對飼料能量要求相對較低。 在草龜養(yǎng)殖中普遍存在體脂含量較高、 生長緩慢的問題。 研究表明，在飼料中添加L-肉堿可顯著提高草龜?shù)纳L速度、降低肝臟中的脂肪含量（武帆等，2021）。為了闡明L-肉堿對草龜脂肪代謝的影響，本試驗通過測定肝臟脂肪代謝酶、血漿脂肪代謝等相關(guān)指標(biāo)，探討L-肉堿在脂肪代謝方面的作用，為肉堿在草龜飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 本研究設(shè)置飼料中L-肉堿添加水平為 0、100、200、300、400、500 mg/kg 的 6個試驗組（L0、L1、L2、L3、L4 和 L5組；L0組為對照組，L1 ～L5組為肉堿添加組），每個試驗組設(shè)8個重復(fù)養(yǎng)殖缸，每個重復(fù)缸內(nèi)養(yǎng)殖10只龜，共480只龜，養(yǎng)殖期為56 d，養(yǎng)殖結(jié)束后測定草龜肝臟脂代謝相關(guān)酶活性和血漿生化指標(biāo)。

1.2 試驗材料 試驗所用基礎(chǔ)飼料以魚粉、雞肉粉、豆粕等為主要蛋白原料，添加不同含量的L-肉堿，采用雙螺桿膨化機(jī)（北京現(xiàn)代機(jī)械技術(shù)有限公司）制成膨化顆粒飼料，蛋白含量為33.33%，能值為 16.44 kJ/g（武帆等，2021）。

試驗所用草龜稚龜購自湖北省天門市草龜養(yǎng)殖場，初均重為（8.28±0.54）g。 草龜經(jīng)藥浴消毒處理后挑選大小均一、活動力強(qiáng)的480只草龜，隨機(jī)分到40個養(yǎng)殖缸中。

1.3 試驗方法 養(yǎng)殖試驗在河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生動物養(yǎng)殖實驗室進(jìn)行， 養(yǎng)殖缸直徑為60 cm，高為70 cm，缸內(nèi)配有電子溫控儀，水溫控制在（30±0.1）℃。 2 周的馴化結(jié)束后，草龜禁食24 h，然后開始正式試驗。各組每日3 次飽足投喂不同L-肉堿含量的飼料，投喂半小時后用虹吸管將剩余餌料吸出，試驗用水為消毒、曝氣之后的自來水，為保持水質(zhì)清潔，每天換水兩次。

試驗結(jié)束后禁食24 h， 從每缸中隨機(jī)選取3只草龜，用MS222（北京綠色恒興生物科技有限公司）麻醉后，斷頭取血，將每只草龜?shù)难謩e放入四周涂抹肝素鈉的2 mL 離心管中， 置于離心機(jī)中離心（4000 g/min，15 min），獲得上清液，進(jìn)行血漿生化指標(biāo)的測定。 隨后在冰盤上對龜體進(jìn)行解剖，分離出肝臟，將肝臟置于液氮中速凍后，儲存在-80 ℃。 后續(xù)測樣時，從每組隨機(jī)選取5個養(yǎng)殖缸，每個養(yǎng)殖缸中隨機(jī)選取一只草龜?shù)母闻K，用于肝臟脂代謝相關(guān)酶活性的測定。

采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定肝臟組織樣本中肝脂酶（HL）、脂肪酶（LPS）和脂蛋白脂酶 （LPL） 的活性。 采用全自動生化儀（mindary BS-180）測定血漿中總蛋白TP、甘油三酯 TG、 總膽固醇 TC、 高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）的含量，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶AST 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT 的活性。

1.4 統(tǒng)計分析 采用Statistica10.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），各試驗組間的差異采用Duncan’s 多重比較，各肉堿添加組與對照組的差異采用LSD 檢驗，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中L-肉堿添加量對草龜肝臟脂代謝相關(guān)酶活的影響 如表1 所示，L1組草龜肝臟的肝脂酶活性[F（5，24）=2.973，P=0.03156 ＜ 0.05]和脂蛋白脂酶活性[F（5，24）=3.156，P=0.02496 ＜ 0.05]較對照組分別提高了94.87%和92.86%。 脂肪酶活性[F（5，24）=0.3445，P=0.8807＞0.05]在各組間無顯著性差異， 但肉堿添加組的脂肪酶活性與對照組相比均有不同程度的升高。

表1 飼料中L-肉堿添加量對草龜肝臟脂代謝相關(guān)酶活的影響

2.2 飼料中L-肉堿添加量對草龜血漿生理生化指標(biāo)的影響 由表2 可知， 各組之間的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性[F（5，24）=3.166，P=0.02466 ＜ 0.05]具有顯著性差異，其中L0組顯著高于其余各組。 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性[F（5，24）=3.297，P=0.02088 ＜ 0.05]在各組間也有顯著性差異，其中L0組顯著高于L2組和L3組，其余各組間沒有顯著性差異，且隨著L-肉堿添加量的提高呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。L2組和L3組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶較對照組分別降低42.57%、45.87%。 總蛋白[F（5，24）=0.6057，P=0.6962＞0.05]、總膽固醇[F（5，24）=0.5572，P=0.7315＞0.05]、甘油三酯[F（5，24）=0.5937，P=0.7050＞0.05]、高密度脂蛋白膽固醇[F（5，24）=0.8291，P=0.5416＞0.05]和低密度脂蛋白膽固醇[F（5，24）=0.3857，P=0.8536＞0.05]在各組之間差異不顯著。

表2 飼料中L-肉堿添加量對草龜血漿生理生化指標(biāo)的影響

3 討論

添加外源性L-肉堿對脂肪代謝的促進(jìn)作用在很多文獻(xiàn)中都有報道， 有著較為一致的結(jié)論（Ozório 等，2012；Hajiabadi 等，2009）。在脂肪酸的β 氧化過程中，L-肉堿作為載體將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體內(nèi)膜， 從而使β 氧化過程順利進(jìn)行，促進(jìn)脂肪的代謝。

肝脂酶和脂蛋白脂酶均屬于脂肪分解酶，是內(nèi)源性甘油三酯代謝的兩種關(guān)鍵酶。 當(dāng)肝脂酶和脂蛋白脂酶缺陷或活性降低時， 肝細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯合成量會增加并在肝內(nèi)堆積（崔璨，2007）。肝脂酶和脂蛋白脂酶活性的降低可引起高血脂癥，且與脂肪肝的發(fā)生有關(guān) （丁雪芬，2007）。 在草魚（Ctenopharyngodon idella） 飼料中添加外源性L-肉堿可顯著提高肝胰臟中肝脂酶和總脂酶的活性，從而促進(jìn)肝胰腺脂肪的降解（田娟，2009）。 茍庚午等 （2016） 研究表明， 在吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）飼料中添加 150 mg/kg 的 L-肉堿，可顯著提高肝臟脂蛋白脂酶、肝脂酶和脂肪酶的活性。 本試驗在添加外源性L-肉堿后，雖然對草龜肝臟脂肪酶的活性并沒有顯著影響， 但可顯著提高肝臟肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性， 整體呈先升高后降低的趨勢， 其中L1組顯著高于對照組，L5組的酶活性還略微低于對照組。 說明草龜飼料中添加100 mg/kg 的L-肉堿，可促進(jìn)肝臟脂肪的分解，但L-肉堿添加劑量過高也會抑制肝臟中脂酶、肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性。

血液中甘油三酯和膽固醇同屬于血脂，是反映脂肪代謝的重要指標(biāo)（丁艷艷，2012）。 根據(jù)現(xiàn)有的研究來看，L-肉堿對不同水產(chǎn)動物血脂水平影響多種多樣。 在飼料中添加L-肉堿可顯著降低歐洲舌齒鱸（Santulli 等，1986）、牙鲆（高小強(qiáng)等，2012）（Paralichthys olivaceus）幼魚和幼鯉（董婧等，2014）血液中甘油三酯和總膽固醇的濃度；而虹鱒飼料中添加外源性L-肉堿， 顯著提高了血漿中甘油三酯和膽固醇的含量 （Jalali 等，2010）。 還有的對血液中甘油三酯和總膽固醇影響不同，如草魚飼料中添加200 mg/kg L-肉堿顯著降低了血清中膽固醇的含量，顯著增加了甘油三酯的含量（田娟等，2009），在吉富羅非魚飼料中添加150 mg/kg L-肉堿可顯著降低血清中甘油三酯的含量， 而對膽固醇含量并未造成顯著影響（茍庚午等，2016）。另外，還有一些魚類，如歐洲舌齒鱸、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）幼魚、羅非魚（Oreochromis spp）和銀鱸（Bidyanus bidyanus）（Jin 等，2019；Yang 等，2012；Yang 等，2009；Dias等，2001）等，在飼料中添加L-肉堿并未對其甘油三酯和膽固醇含量造成顯著影響。 本試驗對草龜?shù)难芯拷Y(jié)果與羅非魚和銀鱸等的相似，添加外源性L-肉堿也未對草龜血漿膽固醇和甘油三酯含量造成顯著影響， 肉堿添加組總膽固醇和甘油三酯含量較對照組均有不同程度的增加。 其原因可能是因為添加L-肉堿促進(jìn)了脂肪酸的氧化， 而脂肪酸氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A 可通過檸檬酸循環(huán)進(jìn)一步氧化， 之后可用于合成酮體、膽固醇和甘油三酯。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性是反映肝功能的指標(biāo)，可用來判斷肝臟是否受到損害。正常情況下，它們在血漿中的活性很低，血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高說明肝細(xì)胞受損（宋國培，1997）。 有研究表明，添加外源性L-肉堿可顯著降低血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性（茍庚午等，2016；高小強(qiáng)等，2012；黃凱等，2010）。本試驗在飼料中添加L-肉堿使得草龜血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降。 說明添加適宜含量的L-肉堿，可對草龜肝臟起到一定的保護(hù)作用。 然而，L-肉堿的添加劑量并非越高越好，本試驗L4 和L5組的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性均有明顯升高的趨勢，如果繼續(xù)加大L-肉堿的添加劑量，可能會對龜體的肝臟產(chǎn)生一定的損害。

4 結(jié)論

在草龜配合飼料中添加100 ～300 mg/kg 的L-肉堿可提高肝臟的脂肪分解能力，促進(jìn)脂肪酸的氧化，在預(yù)防脂肪肝、維護(hù)肝臟功能方面有積極作用。