乙型肝炎病毒在不同丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶狀態(tài)下對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響

高 鵬，雒艷萍，李俊峰△，陳 琳，毛小榮

(1. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染病研究室，2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，3. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染科， 蘭州 730000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人體后主要通過機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害。以T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答功能紊亂在乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵性的作用，輔助性T淋巴細(xì)胞17 (helper T lymphocytes 17, Th17)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (regulatory T lymphocyte, Treg)的變化是這一研究中的熱點(diǎn)之一。同時(shí)HBV感染人體后可處于不同免疫狀態(tài)，臨床上經(jīng)常以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminetransferase, ALT)結(jié)合其他指標(biāo)加以分析判斷，并作出相應(yīng)的治療計(jì)劃，但是目前鮮見有文獻(xiàn)以ALT為節(jié)點(diǎn)判斷在不同免疫狀態(tài)下HBV對(duì)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響，本文就此加以研究分析。

1 資料與方法

1.1 資料

分析2017年1月至2018年12月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院確診為CHB患者336例，其中男268例，女68例，年齡18～60歲，所選患者病例完整。經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，其中ALT正常的CHB患者111例 (ALT<40 U/L)，ALT≥正常上限且<2倍增高的慢性乙肝患者108例 (40 U/L≤ALT<80 U/L)，ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者117例(80 U/L≤ALT),并且按病毒載量分為低復(fù)制組(HBV DNA<4.0 lg copies/mL)、中復(fù)制組(4.0 lg copies/mL≤HBV DNA<6.0 lg copies/mL)和高復(fù)制組(HBV DNA≥6.0 lg copies/mL)。分別觀察在不同組別中不同載量的HBV對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響。同時(shí)對(duì)ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者給予恩替卡韋(entecavir, 0.5 mg/d)治療，隨訪24周，觀察抗病毒前后患者Th17、Treg細(xì)胞頻率及其比率的的變化。CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。同時(shí)排除妊娠期婦女，中、重度脂肪肝患者，酒精肝患者，藥物性肝損傷患者，自身免疫性肝損傷患者，曾經(jīng)接受過抗病毒治療的患者，以及合并其他肝炎感染的患者，及并發(fā)其他心血管、腎臟等重大臟器病變患者。

1.2 儀器

熒光定量PCR分析儀購(gòu)自德國(guó) Lightcycler ROCH公司，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)及配套試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司，AU400型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1HBV定量檢測(cè) 采集患者靜脈血并分離血清，按羅氏 Cobas e 601 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司，瑞士)的操作步驟進(jìn)行定標(biāo)及樣本檢測(cè)。

1.3.2HBV DNA檢測(cè) 采集患者靜脈血并分離血清，按HBV DNA 定量檢測(cè)試劑盒和基因擴(kuò)增儀的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，敏感度>500 copies/mL。

1.3.3外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 的分離及培養(yǎng) 采集研究對(duì)象外周血，肝素抗凝，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)等體積稀釋后，應(yīng)用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離出外周血PBMC，用含 10%(體積分?jǐn)?shù))標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞得到 1×106個(gè)/mL。向 PBMC 懸液加入佛波酯 (12.5 mg /L)、離子霉素(0.25 g /L)、布雷菲德霉素 A(0.75 g /L)、莫能霉素(0.35 g /L) 后于 37.0 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中放置并培養(yǎng) 4 h。

1.3.4外周血 Th17 細(xì)胞檢測(cè) 取培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液100 μL，加入 CD3抗體 10 μL 和CD8 抗體 10 μL 進(jìn)行細(xì)胞表面染色，于 4 ℃避光孵育 30 min。加300 μL PBS 洗滌，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)后棄上清液，然后加入100 μL固定液固定洗滌，于 4 ℃避光孵育30 min，然后加入300 μL PBS，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)棄上清液，再加入100 μL 破膜液進(jìn)行破膜洗滌，然后加入白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-17抗體10 μL 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，于 4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 洗滌，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)后棄上清液，最后加入PBS 300 μL 混勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀對(duì) CD3+CD8-IL-17+T 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5外周血 Treg 細(xì)胞檢測(cè) 取培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液100 μL，加入CD4 抗體 10 μL 和 CD25抗體 10 μL，進(jìn)行細(xì)胞表面染色，于 4 ℃避光孵育 30 min 后，加300 μL PBS 洗滌，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)后棄上清液，加100 μL固定液固定洗滌，于 4 ℃避光孵育 30 min 后接著加入300 μL PBS，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)后棄上清液，再加入100 μL破膜液進(jìn)行破膜洗滌，加入 Foxp3 抗體 10 μL進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，于 4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 洗滌，混勻低速離心 5 min(1 500 r/min)后棄上清液，最后加入PBS 300 μL混勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀對(duì) CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用Dunnett T3方差分析進(jìn)行處理，配對(duì)資料的分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT正常的CHB患者中HBV對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響

對(duì)于ALT正常的CHB患者，HBV載量高低對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率無(wú)明顯影響，詳見表1。

2.2 ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB患者中HBV對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響

對(duì)于ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB患者，HBV載量高低對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率無(wú)明顯影響，詳見表2。

表1 ALT正常組不同病毒載量CHB患者Th17、Treg細(xì)胞及其比率(n=111)Table 1 Th17, Treg cells and their ratio in CHB patients with different viral load in normal ALT group (n = 111)

表2 ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB不同病毒載量組中Th17、Treg細(xì)胞及其比率的方差分析(n=108)Table 2 Variance analysis of Th17, Treg cells and their ratio in CHB with ALT ≥ the upper limit of normal and < 2 times increase in different viral load groups (n = 108)

2.3 ALT≥正常上限2倍的CHB患者中HBV對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響

對(duì)于ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者，隨著病毒載量的增加，Th17細(xì)胞頻率明顯增高，Treg細(xì)胞頻率明顯增高，Th17/ Treg細(xì)胞比率亦明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表3。

表3 ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者不同病毒載量組中Th17、Treg細(xì)胞及其比率的方差分析(n=117)Table 3 Variance analysis of Th17, Treg cells and their ratio in different viral load groups in CHB patients with ALT≥2 times higher than the upper limit of normal (n = 117)

2.4 117例ALT≥正常上限2倍的CHB患者恩替卡韋抗病毒治療前后病毒學(xué)、血清學(xué)指標(biāo)變化

對(duì)于ALT≥正常上限2倍的117例CHB患者采用恩替卡韋(0.5 mg/d)抗病毒治療，治療前后病毒學(xué)、血清學(xué)指標(biāo)變化進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明HBV DNA明顯下降，由(6.37±1.86) lg copies/mL下降為(3.56±1.12) lg copies/mL (t=15.628)。HBsAg由4.38±1.87下降為2.57±1.01 (t=16.849)。HBeAg由4.02±1.75下降為2.32±0.84 (t=14.521)， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。85例患者發(fā)生HBV DNA完全應(yīng)答，完全應(yīng)答率為72.65%，20例患者發(fā)生部分應(yīng)答，部分應(yīng)答率為17.09%，12例患者未發(fā)生應(yīng)答，無(wú)應(yīng)答率為10.25%。8例患者發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(8/39), HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為20.51%，有1例患者發(fā)生HBsAg的陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率為0.85%。

2.5 117例ALT≥正常上限2倍的CHB患者恩替卡韋抗病毒治療前后Th17、Treg細(xì)胞及其比率的變化

對(duì)于ALT≥正常上限2倍增高的117例慢性乙肝患者采用恩替卡韋(0.5 mg/d)抗病毒治療，治療前后Th17、Treg細(xì)胞及其比率的變化進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。相對(duì)于治療前，Th17、Treg細(xì)胞頻率及Th17/Treg細(xì)胞比率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 117例ALT高于正常上限2倍的CHB患者恩替卡韋治療前后Th17、Treg細(xì)胞及其比率的變化 (n = 117)Table 4 Changes of Th17, Treg cells and their ratios before and after entecavir treatment in CHB patients with ALT≥2 times higher than the upper limit of normal (n = 117)

3 討論

患者感染HBV后，可處于不同的免疫狀態(tài)，即免疫應(yīng)答期和免疫耐受期[2]。根據(jù)ALT的正常與否，結(jié)合臨床癥狀和體征，將HBV感染者分為HBV攜帶者和乙型肝炎患者[3]。ALT在HBV攜帶者中通常正?；蜉p微增高，而在CHB患者中常出現(xiàn)2倍以上的增高。臨床上依據(jù)ALT并結(jié)合臨床癥狀與體征對(duì)不同階段的乙型肝炎感染者采取不同的臨床治療手段，對(duì)HBV攜帶者密切觀察，而對(duì)乙型肝炎患者則積極進(jìn)行抗病毒治療[4]。病理性免疫反應(yīng)是乙型肝炎發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，特別是以T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫機(jī)制紊亂在乙型肝炎的發(fā)病環(huán)節(jié)中處于重要地位[5]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞亞群Th17、Treg細(xì)胞及其比率與乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[6-8]。Th17細(xì)胞作為一種典型的促炎細(xì)胞，通過分泌IL-17等炎性因子，集聚中性粒細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)，參與到肝臟的損傷過程以及HBV的清除[9-10]，而Treg細(xì)胞主要通過調(diào)節(jié)自身T淋巴細(xì)胞，分泌抗炎性因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等抑制CD4+、CD8+T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，維持自身免疫耐受[11-12]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg值與肝損傷程度呈正相關(guān)，Th17/Treg在介導(dǎo)抗病毒治療的免疫應(yīng)答中起重要作用[13]，但是目前少有以ALT分組探討在不同ALT狀態(tài)下，Th17、Treg及其比值與HBV載量高低的相互關(guān)系以及對(duì)機(jī)體免疫功能影響的報(bào)道。

本研究中顯示，在ALT正常組和≥正常上限、且小于2倍增高的CHB組中，不同載量的HBV對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響甚微，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示機(jī)體大多處于免疫耐受狀態(tài)，HBV與機(jī)體互相適應(yīng)，互不干涉，未能引起機(jī)體強(qiáng)烈的病理性免疫反應(yīng)。機(jī)體的T、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞未對(duì)HBV的入侵作出強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，機(jī)體肝功能指標(biāo)大多正?；蜉p微增高，肝損傷、炎癥不顯著[14]。本研究中，HBV載量的高低不同對(duì)Th17、Treg細(xì)胞及其比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)對(duì)這個(gè)階段的患者需密切觀察，定期復(fù)查，而不采用抗病毒治療。

對(duì)于ALT≥正常上限2倍增高的CHB而言，本研究顯示，隨著病毒載量的增加，Th17、Treg細(xì)胞及其比率均明顯增高。在此階段，機(jī)體大多處于免疫應(yīng)答階段，機(jī)體的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞大多被激活，與HBV進(jìn)行著抗?fàn)?，隨著病毒載量的增加，這種病理性的免疫反應(yīng)愈強(qiáng)烈，肝的炎癥反應(yīng)愈強(qiáng)烈，損傷愈大，肝功能指標(biāo)大多異常[15]。同樣的情況也反映在Th17、Treg細(xì)胞及其比率上，隨著病毒載量的增加，Th17細(xì)胞明顯增加。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[16]。在HBV感染患者中，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞損傷，隨著病毒載量的增加，Th17細(xì)胞也隨之增加，機(jī)體的炎癥反應(yīng)更加強(qiáng)烈，機(jī)體加大清除HBV的力度，同時(shí)機(jī)體的損傷也更加明顯。在此階段，隨著病毒載量的增加，Treg細(xì)胞也逐漸增加，Treg細(xì)胞是一種免疫抑制細(xì)胞，與Th17細(xì)胞相輔相成，共同調(diào)節(jié)著機(jī)體的免疫機(jī)制[17]。隨著病毒載量的增加，Th17細(xì)胞數(shù)量增加，機(jī)體的病理性免疫反應(yīng)增強(qiáng)，機(jī)體為了調(diào)控這一病理性免疫反應(yīng)機(jī)制，Treg細(xì)胞也隨之增加，而使得病理性免疫反應(yīng)得以控制，不至于過于強(qiáng)烈，而對(duì)于Th17/Treg細(xì)胞比率而言，有研究顯示，Th17/Treg細(xì)胞比率與肝損傷程度呈正相關(guān)，Th17/Treg 的失衡加重肝損傷，修復(fù) Th17/Treg 平衡對(duì) HBV 感染相關(guān)肝病可能是一種新的免疫療法[18-20]。在本研究中，對(duì)于ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者，隨著病毒載量的增加，Th17/Treg細(xì)胞比率也同樣隨之增高，反映Th17這一炎性細(xì)胞的增長(zhǎng)速度明顯高于Treg細(xì)胞這一抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞的增長(zhǎng)速度，表明隨著病毒載量的增加，機(jī)體促進(jìn)炎性反應(yīng)的因素明顯高于抑制作用，機(jī)體抗病毒反應(yīng)明顯增強(qiáng)，同時(shí)炎癥損傷也增大。

本研究對(duì)ALT≥正常上限2倍的CHB患者采用恩替卡韋抗病毒治療，并隨訪24周，其血清學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)顯示，恩替卡韋治療24周后，患者HBV DNA明顯下降。ALT≥正常上限2倍增高是抗病毒治療的適應(yīng)證之一，這是肝病界醫(yī)生公認(rèn)的指證。恩替卡韋是目前CHB患者治療的一線用藥，也是國(guó)內(nèi)外指南推薦的首選核苷類抗病毒藥物，本研究中對(duì)這類患者積極進(jìn)行恩替卡韋抗病毒治療，病毒學(xué)指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)均取得了很好的改善。由本研究可見，隨著病毒載量的下降，Th17和Treg細(xì)胞頻率明顯下降，反映出隨著機(jī)體炎癥反應(yīng)的減弱，機(jī)體平衡炎癥反應(yīng)的能力也隨之減輕，而Th17/Treg細(xì)胞比率也隨之降低，反映機(jī)體炎癥反應(yīng)趨緩，建立了新的免疫平衡。

綜上所述，在不同的ALT狀態(tài)下，HBV載量高低對(duì)機(jī)體Th17、Treg細(xì)胞及其比率的影響是不同的，可以從免疫學(xué)的角度出發(fā)，進(jìn)一步深入探討臨床上以ALT分組治療患者的科學(xué)意義。