金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制及治療進(jìn)展

陳詩琪，黃珊，談琦，藍(lán)麗芳，楊濤，溫增勇，萬春雷，李龍年

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，江西 贛州 341000；3.上猶縣中醫(yī)院皮膚科，江西 上猶 341200）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus），也稱金葡菌，是厚壁菌門的一種革蘭氏陽性非移動凝固酶陽性球菌，是人類皮膚和黏膜表面的常見定植菌，是導(dǎo)致醫(yī)療機(jī)構(gòu)和社區(qū)感染的重要病原體［1］。定植的金葡菌可通過皮膚或黏膜的裂口引起局部感染，如毛囊炎、癤和癰，嚴(yán)重時產(chǎn)生危及生命的侵襲性感染，如菌血癥、膿毒血癥、重癥肺炎、心內(nèi)膜炎、骨關(guān)節(jié)炎以及中毒性休克綜合征［2］。隨著20世紀(jì)40年代青霉素的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，金葡菌感染病死率明顯下降，但青霉素的廣泛使用，導(dǎo)致耐青霉素的金葡菌出現(xiàn)［3］。耐青霉素金葡菌通過產(chǎn)生青霉素酶水解青霉素β內(nèi)酰胺環(huán)，而對青霉素產(chǎn)生耐藥。隨之科學(xué)家研發(fā)了一種新的耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林［4］。甲氧西林自1959年應(yīng)用于臨床后有效控制了耐青霉素金葡菌的感染。然而，在應(yīng)用甲氧西林僅2年后，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）菌株出現(xiàn)［5］。甲氧西林耐藥性是由于獲得了一個編碼青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs）的新基因mecA，該基因可整合到對甲氧西林敏感的金葡菌的染色體元件（SCCmec）中［6］，從而使這類金葡菌對所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類耐藥［7］。MRSA多重耐藥已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。

1 金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制

金葡菌的耐藥機(jī)制包括天然耐藥與獲得耐藥，天然耐藥包括外膜通透性下降、生理性外排系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶的過量產(chǎn)生；獲得耐藥包括基因突變、耐藥基因的獲得、生物膜的介導(dǎo)、存留細(xì)胞的存在。

1.1 天然耐藥

1.1.1 外膜滲透性當(dāng)細(xì)胞膜通透性降低時，細(xì)菌的能量代謝受到影響，吸收藥物減少，耐藥產(chǎn)生［8］。例如，金葡菌對氨基糖苷類藥物的耐藥是由膜滲透性降低引起藥物攝入的減少導(dǎo)致［9］。

1.1.2 外排系統(tǒng)主動外排系統(tǒng)是細(xì)菌正常的生理結(jié)構(gòu)，存在于敏感菌株中［10］。當(dāng)環(huán)境中底物長期誘導(dǎo)，細(xì)菌外排系統(tǒng)編碼基因被激活并表達(dá)，外排藥物的能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致耐藥出現(xiàn)［11］。

主動藥物外排系統(tǒng)在對多種藥物的耐藥性中發(fā)揮作用［12］。金黃色葡萄球菌外排系統(tǒng)NorA、NorB、NorC、QacA屬于MFS家族，是跨膜質(zhì)子能驅(qū)動型外排系統(tǒng)［13］。其氨基酸序列高度保守，表現(xiàn)為12或14個跨膜蛋白，其中NorA蛋白是金葡菌的主要多藥外排蛋白，由位于染色體Sma1D片段上的NorA基因編碼。通過質(zhì)子-藥物反向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將抗菌化合物轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜，NorA可排出大量結(jié)構(gòu)不同的小分子化合物，包括氟喹諾酮類藥物、溴化乙啶以及季銨鹽類等殺菌劑，使得抗菌敏感性降低［14］。金黃色葡萄球菌的Qac轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是由主要易化子超家族QacA和QacR基因構(gòu)成的質(zhì)粒編碼。QacA也屬于多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌可通過攜帶抗消毒劑QacA基因，表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而對克林霉素、慶大霉素、紅霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素及青霉素均有較高的耐藥性［15］。多藥泵送蛋白都是質(zhì)子驅(qū)動蛋白。也就是說，物質(zhì)交換不是依靠ATP水解來釋放能量，而是通過細(xì)胞膜兩側(cè)H+形成的電化學(xué)梯度來進(jìn)行的［16］。

1.1.3 β-內(nèi)酰胺酶β-內(nèi)酰胺酶即青霉素酶，是一種催化多種β-內(nèi)酰胺類抗生素（包括碳青霉烯類廣譜抗生素）水解的酶，由位于質(zhì)粒上的blaZ基因編碼，具有可轉(zhuǎn)移性［17］。β-內(nèi)酰胺類抗生素對細(xì)菌致死作用的機(jī)制：一是與PBPs結(jié)合，抑制細(xì)胞壁黏蛋白合成，破壞細(xì)胞壁；二是觸發(fā)細(xì)菌的自溶酶活性導(dǎo)致細(xì)菌溶解［18］。目前的研究表明，MRSA耐藥機(jī)制主要有兩種［19］：一是水解反應(yīng)，即β-內(nèi)酰胺酶水解并滅活β-內(nèi)酰胺類抗生素；二是擠壓機(jī)制，即大量β-內(nèi)酰胺酶快速牢固地結(jié)合胞外抗生素，阻止抗生素到達(dá)胞內(nèi)空間，因此抗生素?zé)o法到達(dá)靶位，最終導(dǎo)致MRSA對抗生素耐藥［20］。

1.2 獲得耐藥

1.2.1 基因突變金葡菌可通過靶DNA回旋酶或外膜蛋白的基因突變而產(chǎn)生耐藥性，從而減少藥物積累［21-22］。例如，對克林霉素和紅霉素的耐藥性是由核糖體RNA甲基化酶基因突變引起蛋白修飾的改變而引起的［23］。

1.2.2 耐藥基因的獲得這是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥［24］。質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及耐藥基因的插入，可產(chǎn)生過量的β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥［25］。MRSA通過質(zhì)粒介導(dǎo)獲取編碼PBPs的mecA基因，mecA基因整合到對甲氧西林敏感的金葡菌染色體元件（SCCmec）中，導(dǎo)致敏感菌株耐藥。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在金葡菌之間，也發(fā)生在金葡菌和其他細(xì)菌之間［26］。例如，MRSA可以從腸球菌中獲得耐藥質(zhì)粒，進(jìn)一步擴(kuò)大和增強(qiáng)其耐藥性［27］。

1.2.3 生物膜的介導(dǎo)細(xì)菌生物膜是由附著在基質(zhì)表面的微生物種群組成的細(xì)胞外復(fù)合結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部微生物被自身產(chǎn)生的高度水合的細(xì)胞外聚合物基質(zhì)所包圍，是細(xì)菌適應(yīng)周圍環(huán)境的一種保護(hù)性生存方式［28-29］。自然界中絕大多數(shù)細(xì)菌都以生物膜的形式存在，其最突出的特征是它們強(qiáng)大的黏附力和耐藥性，這使得細(xì)菌能抵抗宿主的免疫反應(yīng)，逃避抗生素的殺滅［30］。它們對抗菌藥物的耐藥性可以是浮游生物的1 000倍。目前，國內(nèi)外抗生物膜治療主要集中在新型抗菌藥物的研發(fā)上［29］。研究發(fā)現(xiàn)，生物膜使細(xì)菌更易對常規(guī)藥物產(chǎn)生耐藥，而中藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用可降低細(xì)菌耐藥的出現(xiàn)［30］。

1.2.4 存留細(xì)胞的存在存留細(xì)胞是微生物種群中遺傳同源但表型異質(zhì)的一小部分細(xì)胞，生長緩慢或休眠，在高濃度抗生素下存活［31］。早期研究表明，與抗生素耐藥性不同，細(xì)菌存留是細(xì)菌暫時抵抗抗生素壓力的一種生理狀態(tài)，不會導(dǎo)致基因型的改變［32］。然而，由于高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，這種說法受到了挑戰(zhàn)。存留細(xì)胞的存在給完全消除細(xì)菌感染和預(yù)防反復(fù)感染制造了障礙［31］?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，細(xì)菌存留的機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)的信號通路包括毒素-抗毒素系統(tǒng)、細(xì)胞生理性能量代謝和蛋白質(zhì)及核酸合成、DNA保護(hù)和修復(fù)系統(tǒng)、蛋白酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)譯、外泵系統(tǒng)等［31］，具體信號通路及機(jī)制仍需大量研究。

2 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制

青霉素用于臨床不久便發(fā)現(xiàn)了耐藥菌珠，隨后的20年，研究發(fā)現(xiàn)，大約80%的菌株通過獲取編碼β-內(nèi)酰胺酶的blaZ基因獲得了對青霉素的耐藥性，該酶通過水解關(guān)鍵的β-內(nèi)酰胺環(huán)使青霉素失活［33］。為應(yīng)對青霉素耐藥在全球范圍的內(nèi)擴(kuò)散，半合成耐青霉素酶類藥物，如甲氧西林以及后來的苯唑西林被開發(fā)用于臨床。甲氧西林于1961年被引入臨床實(shí)踐，同年晚些時候，在英國一家醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了第一個臨床MRSA分離株［34］。MRSA對β-內(nèi)酰胺抗菌藥物產(chǎn)生耐藥主要原因有兩個。其一：MRSA產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶從而滅活甲氧西林。β-內(nèi)酰胺酶是由β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因blaZ所編碼，其表達(dá)受到blaR1和blaI基因調(diào)控，blaR1基因編碼有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白blaR1，blaI基因編碼blaZ基因負(fù)性調(diào)控蛋白blaI。在正常狀態(tài)下，β-內(nèi)酰胺酶處于抑制狀態(tài)。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時，blaZ基因被激活并開始表達(dá)，MRSA產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使β-內(nèi)酰胺環(huán)水解，使甲氧西林失效［35］。其二：MRSA獲得由mecA編碼的與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力低的青霉素結(jié)合蛋白2a（penicillin binding protein 2a,PBP2a），其由mecA基因編碼。mecA基因存在于一個被稱為SCCmec的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的遺傳元件家族中，這些元件通常攜帶額外的基因，賦予對其他抗生素和有害物質(zhì)（如重金屬）的耐藥性［36］，一些證據(jù)表明，SCCmec進(jìn)化發(fā)生在sciur葡萄球菌群中，這是經(jīng)常在家畜的皮膚上定居的葡萄球菌的一個原始群體［37］。PBP2a與屬于sciur葡萄球菌群編碼的原生PBPs非常相似。但是，把一個祖先基因進(jìn)化成一個抗性決定因子需要大量的基因改變［37］。與這一發(fā)現(xiàn)相一致的是，在引進(jìn)甲氧西林之前，青霉素和其他第一代β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用似乎是金黃色葡萄球菌選擇攜帶mecA抗性的決定因素［38］。mecA基因轉(zhuǎn)錄受mecI-mecR1和blaI-blaR1兩套調(diào)控基因的調(diào)控；mecI、mecR1基因分別編碼抑制蛋白mecI與傳感器蛋白mecR1，blaI、blaR1基因分別編碼抑制蛋白blaI與誘導(dǎo)蛋白blaR1。對于MRSA菌株，其大部分耐藥是由mecA基因介導(dǎo)，但是小部分MRSA不攜帶mecA基因，存在其他耐藥機(jī)制。在許多研究中發(fā)現(xiàn)，90%以上的MRSA都含有mecA基因，并且對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物高度耐藥的MRSA中mecA的檢出率極高［35］。

3 針對MRSA的抗生素研究以及治療新策略

MRSA具有易感染、高死亡率和多重耐藥的特點(diǎn)，目前已成為臨床治療的絆腳石［4］。如何有效預(yù)防和控制MRSA也成為研究熱點(diǎn)。目前MRSA的一線治療通常包括服用大劑量抗生素，包括萬古霉素、利奈唑胺或頭孢他林；然而，在過去20年中，出現(xiàn)了對這些抗生素耐藥的臨床分離菌［39］?？股啬退幮酝ㄟ^阻止對細(xì)菌、寄生蟲、病毒和真核病原體的有效治療而威脅全球健康，濫用或過度使用抗生素將加速耐藥變體的選擇［40］。由于所有生物體都進(jìn)化出了基因突變來防止致命的選擇壓力，抗生素耐藥性是不可避免的進(jìn)化結(jié)果。如今，抗生素的耐藥性普遍存在，新藥的供應(yīng)已經(jīng)耗盡。因此，迫切需要替代策略和新型抗菌劑來解決抗生素耐藥性問題［41］。

從分子水平對耐藥菌株耐藥機(jī)制的深入研究，促進(jìn)了新藥研發(fā)的進(jìn)展。目前研發(fā)中的大多數(shù)小分子抗生素和最近批準(zhǔn)的小分子抗生素多是對現(xiàn)有抗生素化學(xué)支鏈的修飾。因此，抗生素的交叉耐藥性可以出現(xiàn)，正如對最近批準(zhǔn)的氟喹諾酮類藥物地拉沙星的耐藥［42］。不過，新的膜靶向抗生素正在開發(fā)中，如非肽防御素模擬藥物磷酸二酯酶4的新型抑制劑brilacidin。brilacidin雖然在結(jié)構(gòu)上與環(huán)脂肽類抗生素達(dá)托霉素不同，但是細(xì)胞效應(yīng)與達(dá)托霉素相似［43］。尋求新的治療的另一個途徑是通過抑制獲得性耐藥機(jī)制或抑制抗生素耐藥所需的核心細(xì)胞功能來重新使耐藥株敏感［42］。另外，影響編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的表達(dá)也是增加MRSA對β-內(nèi)酰胺類藥物易感性的方法，抗精神病藥物噻利嗪證明了這一點(diǎn)，它降低了Meca和blaZ的轉(zhuǎn)錄和PBP2a的表達(dá)［44］。也有聯(lián)合治療的方案報(bào)道，如硫唑嘌呤聯(lián)合雙氯西林對VISA菌株具有抑制作用［45］。

目前極具潛力的是替代治療策略，包括抗體治療、抗病毒治療、噬菌體和疫苗［46］?？贵w治療目前正研發(fā)的有兩種類型，即與病原體結(jié)合以促進(jìn)調(diào)理吞噬作用的抗體和中和毒性因子如毒素的抗體［47］。金葡菌具有多種毒力因子，單一因子的中和作用通常不足以對抗金葡菌感染，因此，結(jié)合不同靶標(biāo)的單克隆抗體的混合物正在研發(fā)中?？共《局委煹牟呗允墙獬齾⑴c疾病進(jìn)展的關(guān)鍵毒力因子，細(xì)菌清除依賴于功能性免疫系統(tǒng)或聯(lián)合使用抗生素［48］。已證明靶向金葡菌控制其毒力因子產(chǎn)生的調(diào)控因子介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)而抑制主要毒力因子如α-溶血素對金葡菌的定植和感染都有影響［49］。噬菌體是專門針對細(xì)菌的病毒，隨著抗生素的應(yīng)用，噬菌體療法被舍棄。但抗生素耐藥性帶來的困難重新激起了醫(yī)學(xué)對噬菌體療法的興趣。目前已有幾種針對金葡菌的噬菌體療法正在測試［50］。

總之，金葡菌特別是MRSA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)分子靶點(diǎn)和信號通路仍需大量研究。目前有一系列新的治療選擇正在探索中，不久的將來這些新的治療策略將揭示它們對金葡菌感染的療效和治療潛力。