淡豆豉提取物不同溶劑萃取物的抗氧化活性

劉俊澤 胡力銘 王仁廣 王淑敏 王 歡

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

淡豆豉(fermented soya beans)是豆科植物大豆(黑豆)的成熟種子與中藥青蒿、桑葉經(jīng)發(fā)酵得到的加工品[1]，是一種歷史悠久的健康食品[2]，被衛(wèi)生部列在中國(guó)首批藥食兩用名單中[3]。其含有多種天然活性成分，如大豆異黃酮、豆豉多糖、大豆皂苷、大豆低聚糖、維生素以及發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的纖溶酶、γ-氨基丁酸等[4-5]，具有降血脂、降血壓、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防骨質(zhì)疏松等保健作用[6-7]；臨床上還可用于治療感冒、寒熱頭痛、煩燥胸悶、虛煩不眠等病癥[8]。目前淡豆豉抗氧化活性的研究主要集中于大豆異黃酮類、豆豉多糖、大豆皂苷等成分，但有關(guān)淡豆豉粗提物不同溶劑萃取物抗氧化活性成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

自由基是一種廣泛存在于人體細(xì)胞中的游離基[9]，與人體的新陳代謝、正常生長(zhǎng)發(fā)育以及疾病發(fā)生等有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中的多糖[10]、異黃酮[11]、大豆皂苷等成分在體外表現(xiàn)出良好的自由基清除能力，可被用作天然抗氧化劑添加到食品中。試驗(yàn)擬采用70%乙醇對(duì)淡豆豉進(jìn)行提取，并用不同溶劑對(duì)粗提物進(jìn)行萃取，測(cè)定粗提物與各萃取物中總黃酮、總多糖以及6種大豆異黃酮含量，評(píng)價(jià)粗提物與不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基的清除能力，并進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)淡豆豉抗氧化食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

淡豆豉：批號(hào)36919004，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王淑敏教授鑒定為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟種子(黑豆)的發(fā)酵加工品，河北仁心藥業(yè)有限公司；

蘆丁、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃素、黃豆黃苷標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)分別為DST191011-020、DST190819-019、DST190915-002、DST200319-003、DST190819-009、DST1903312-008，HPLC≥98%，成都德斯特生物科技有限公司；

2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

過(guò)硫酸鉀：分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司；

L-抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

無(wú)水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-2030型，島津(中國(guó))有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Infinte M200 Pro型，TECAN帝肯(中國(guó))有限公司；

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

萬(wàn)分之一電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多國(guó)際有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 稱取200 g淡豆豉干燥粉末，以料液比(m淡豆豉∶V乙醇)1∶10 (g/mL)加入70%乙醇[12-13]，超聲處理(120 W，40 kHz)1 h，重復(fù)3次，合并提取液，過(guò)濾，減壓濃縮，干燥至恒重，得50.54 g浸膏。

取32.00 g浸膏，加水制成懸濁液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，共3次，合并萃取液，過(guò)濾，減壓濃縮，干燥至恒重得不同極性部位萃取物。分別取適量粗提物及各溶劑萃取物，用70%乙醇配制成2.0 mg/mL 的溶液作為供試品。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14-15]稍作修改，分別吸取3 mL粗提物及各溶劑萃取物供試品于10 mL具塞試管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.40 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.40 mL，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，混勻，靜置15 min。以蘆丁作為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以70%乙醇代替各供試品溶液作為空白對(duì)照。測(cè)定506 nm處吸光度，計(jì)算粗提物與各萃取物中總黃酮含量，結(jié)果以每克萃取物含有的總黃酮的毫克數(shù)表示(mg/g)。

1.2.3 總多糖含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]稍作修改，將各供試品溶液稀釋至0.5 mg/mL，各取1 mL于10 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)20 min。以無(wú)水葡萄糖作為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以70%乙醇代替各萃取物溶液作為空白對(duì)照。測(cè)定490 nm處吸光度，計(jì)算粗提物與各萃取物中總多糖含量，結(jié)果以每克萃取物含有的總多糖的毫克數(shù)表示(mg/g)。

1.2.4 大豆苷等6種大豆異黃酮含量測(cè)定 色譜柱為安捷倫 ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%磷酸(A)—乙腈(C)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；梯度洗脫程序?yàn)?～5 min，17% A；5～26 min，17%～28% A；26～30 min，28% A；30～33 min，28%～30% A；33～38 min，30%～35% A；38～43 min，35% A；43～45 min，35%～17% A；55 min，17% A。對(duì)萃取物中6種異黃酮類成分進(jìn)行指認(rèn)，并根據(jù)各化合物峰面積與相應(yīng)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，結(jié)果以每克萃取物所含該種異黃酮的毫克數(shù)表示(mg/g)。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[17]，并按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

c——自由基清除率，%；

A2——供試品溶液吸光度值；

A1——空白對(duì)照組溶液吸光度值；

A0——溶劑代替不同供試品溶液吸光度值。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[18]，并按式(1)計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.2.7 OH自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]，并按式(1)計(jì)算OH自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010、SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、相關(guān)性分析及圖像繪制，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為(x±s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量分析

2.1.1 總黃酮、總多糖含量 由表1可知，乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高為(92.912±1.130)mg/g，其次為正丁醇萃取物，說(shuō)明淡豆豉中的黃酮類成分大多為中等極性。正丁醇萃取物中的總多糖含量最高為(83.381±0.754)mg/g，其次是萃余物、70%乙醇粗提物、乙酸乙酯萃取物。說(shuō)明淡豆豉中所含有的黃酮、多糖類化學(xué)物質(zhì)可被中強(qiáng)極性(乙酸乙酯、正丁醇)溶劑富集，推測(cè)這些物質(zhì)屬于中強(qiáng)極性物質(zhì)。

表1 粗提物與不同溶劑萃取物中總黃酮、總多糖含量測(cè)定結(jié)果?Table 1 Determination results of total flavonoids,and total polysaccharides in crude extract and different solvent extracts

2.1.2 6種大豆異黃酮含量 由圖1和表2可知，正丁醇萃取物中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量均顯著高于其他萃取物，含量分別為(2.042±0.053)，(8.074±0.006)，(21.366±0.117)，(11.686±0.003)mg/g。黃豆黃苷在乙酸乙酯萃取物中富集最多，達(dá)(4.917±0.026)mg/g。黃豆黃素在二氯甲烷萃取物中含量最高，為(4.664±0.011)mg/g。綜上，正丁醇可以較好地萃取淡豆豉中的異黃酮成分，其次為乙酸乙酯，而萃余部位中的6種異黃酮含量低于檢測(cè)限。

1.大豆苷 2.黃豆黃苷 3.染料木苷 4.大豆苷元 5.黃豆黃素 6.染料木素 S1.萃余物 S2.石油醚萃取物 S3.二氯甲烷萃取物 S4.乙酸乙酯萃取物 S5.70%乙醇粗提物 S6.正丁醇萃取物 S7.6種大豆異黃酮混標(biāo)圖1 粗提物與各溶劑萃取物HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of the crude extract and the solvent extracts

表2 粗提物與各溶劑萃取物中6種異黃酮含量?Table 2 Determination results of 6 isoflavones in crude extract and solvent extracts mg/g

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 由圖2可知，淡豆豉粗提物與各溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基的清除作用均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，正丁醇萃取物與乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，IC50分別為(0.371±0.007)，(0.499±0.007)mg/mL，在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者對(duì)DPPH自由基的清除作用雖弱于抗壞血酸，但隨質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)DPPH自由基清除作用可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)；其次為70%乙醇粗提物部位，其對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為(0.867±0.020)mg/mL；萃余物與二氯甲烷萃取物對(duì)DPPH自由基的清除作用較接近，IC50分別為(1.216±0.098)，(1.814±0.037)mg/mL；石油醚萃取物對(duì)DPPH自由基的清除能力最弱。

圖2 粗提物、各溶劑萃取物的DPPH自由基清除活性Figure 2 DPPH free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.2 ABTS自由基清除活性 由圖3可知，隨著粗提物與各溶劑萃取物質(zhì)量濃度的升高，ABTS自由基的清除能力也增強(qiáng)，其中抗壞血酸對(duì)ABTS自由基的清除能力明顯高于粗提物和各萃取物。正丁醇萃取物對(duì)ABTS自由基的清除能力優(yōu)于粗提物與其他萃取物，其IC50為(0.199±0.003)mg/mL；其次為乙酸乙酯萃取物和70%乙醇粗提物，IC50分別為(0.203±0.008)，(0.264±0.003)mg/mL；除正丁醇萃取物外，其余萃取物在質(zhì)量濃度為0.0～0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除能力接近，當(dāng)質(zhì)量濃度>0.2 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯萃取物的清除能力略高于70%乙醇粗提物和二氯甲烷萃取物；萃余物與二氯甲烷萃取物清除ABTS自由基的IC50分別為(0.405±0.010)，(0.336±0.008)mg/mL，較為接近；石油醚萃取物對(duì)ABTS自由基的清除能力最弱。

圖3 粗提物、各溶劑萃取物的ABTS自由基清除活性Figure 3 ABTS free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.3 OH自由基清除活性 由圖4可知，淡豆豉粗提物與各溶劑萃取物對(duì)OH自由基均具有一定的清除作用，且趨勢(shì)相近，其中正丁醇萃取物清除OH自由基能力優(yōu)于粗提物及其他萃取物，IC50為(0.162±0.002)mg/mL，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度<0.4 mg/mL時(shí)，正丁醇萃取物與抗壞血酸對(duì)OH自由基的清除能力相近，當(dāng)質(zhì)量濃度>0.4 mg/mL 時(shí)，抗壞血酸的清除能力優(yōu)于正丁醇萃取物；其次為乙酸乙酯萃取物，IC50為(0.166±0.006)mg/mL，略低于正丁醇萃取物；70%乙醇粗提物、二氯甲烷萃取物、石油醚萃取物及萃余物對(duì)OH自由基的清除能力較弱，最弱為石油醚萃取物。

圖4 粗提物、各溶劑萃取物的OH自由基清除活性Figure 4 OH radical scavenging activity of crude extract and solvent extracts

2.3 抗氧化能力與總黃酮、總多糖及6種異黃酮含量的相關(guān)性

由表3可知，總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基的清除能力顯著相關(guān)(P<0.05)；總多糖含量與DPPH自由基的清除能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，與ABTS自由基的清除能力顯著相關(guān)(P<0.05)?？傸S酮含量與6種大豆異黃酮含量均表現(xiàn)出相關(guān)性，異黃酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷及染料木素含量與3種自由基的清除能力極顯著相關(guān)(P<0.01)；黃豆黃苷含量與DPPH自由基和OH自由基的清除能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，與ABTS自由基的清除能力顯著相關(guān)(P<0.05)。

表3 抗氧化能力與總黃酮、總多糖及6種異黃酮含量的相關(guān)性?Table 3 Correlation analysis of antioxidant capacity and content of total flavonoids,total polysaccharides and 6 kinds of isoflavones

3 結(jié)論

采用3種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，對(duì)淡豆豉粗提物的不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，正丁醇萃取物的抗氧化活性高于其他萃取物，其總多糖含量最高，總黃酮含量?jī)H次于乙酸乙酯萃取物的，且其中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量明顯高于粗提物及其他萃取物的。由相關(guān)性分析結(jié)果可知，總黃酮含量與3種抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性最大，總多糖含量的次之。3種抗氧化活性指標(biāo)與大豆異黃酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量極顯著相關(guān)(P<0.01)，與黃豆黃苷含量顯著相關(guān)(P<0.05)。綜上，總黃酮中的大豆異黃酮類成分是發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)，特別是大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素這4種大豆異黃酮，而正丁醇可以較好地萃取淡豆豉中的這4種大豆異黃酮，是抗氧化成分的最優(yōu)萃取溶劑。淡豆豉在發(fā)酵過(guò)程中，結(jié)合型的大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化成游離型的大豆異黃酮苷元，使其具備更強(qiáng)的抗氧化能力；此外，淡豆豉的發(fā)酵工藝以及引入的輔料青蒿、桑葉對(duì)淡豆豉的抗氧化活性影響有待進(jìn)一步探究；后續(xù)將繼續(xù)探究淡豆豉的炮制工藝，以及淡豆豉中大豆皂苷、大豆蛋白等其他成分與抗氧化活性間的關(guān)系以及作用機(jī)理。