基于Nrf2/ARE信號通路研究姜葉三七揮發(fā)油對氧化低密度脂蛋白誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

劉新燕 王羽 尚峰 孫建翔 王敏慧 徐勤

中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。姜科植物大多為多年生草本，具有芳香性，包含很多著名的藥材和香料植物[1]。姜葉三七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib]又名土田七，為姜科植物姜葉三七的干燥塊根，具有活血化瘀、消腫止痛、止血散瘀的功效[2]。姜葉三七揮發(fā)油(Essential oil fromStahlianthusinvolucratusrhizomes, EOSIR)是從姜葉三七干燥塊根中提取制備的一種油狀液滴，主要成分包括單萜類、倍半萜類、酯類和芳香烴類化合物等。本課題組前期研究表明，EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有很好的療效。但目前對于姜葉三七及其主要有效成分揮發(fā)油在治療心血管方面的藥理作用研究在國內(nèi)外未見報道。因此，本實驗將繼續(xù)深入探討其在治療動脈粥樣硬化方面的藥效及其作用機制。

近年來，核因子E2相關因子2(nuclear factory erythroid-2 related, Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)信號通路一直是研究的焦點，是機體最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激和防御信號通路[3-6]。當機體處于生理狀態(tài)時，細胞內(nèi)的Nrf2被Keap1蛋白結合在細胞質中，使Nrf2處于一種非游離狀態(tài)并且不斷降解的非活性低水平狀態(tài)。當受到親電試劑的刺激或處于氧化應激條件下，細胞內(nèi)的Nrf2解除偶聯(lián)[7]，游離出Nrf2在細胞質中積累并轉移進入細胞核與ARE相互結合，激活細胞保護基因，發(fā)揮保護細胞的作用[8-9]。

本實驗在EOSIR對血管內(nèi)皮功能調控作用的基礎上，提出EOSIR可通過Nrf2/ARE信號通路保護血管內(nèi)皮損傷作用及其機制的假說，應用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導血管內(nèi)皮細胞建立氧化損傷模型，運用流式細胞術及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot， WB)等現(xiàn)代分子生物學技術，探討姜葉三七揮發(fā)油對損傷的血管內(nèi)皮保護作用及其機制，旨在為姜葉三七資源的合理利用和開發(fā)提供一定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物

氧化低密度脂蛋白(大連美侖生物技術有限公司，批號：MB12474)；阿司匹林標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100113-201706)；姜葉三七(南寧神能堂保健品科技有限公司，批號：110516)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定。

1.3 實驗試劑

人乳酸脫氫酶試劑盒，批號：A02022；總超氧化物歧化酶測定試劑盒，批號：A00132；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒，批號：A00312；谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒，批號：A00512；一氧化氮(nitric oxide，NO)測定試劑盒，批號：01212；過氧化氫酶(catalase，CAT)測定試劑盒，批號：A00711；以上均購自南京建成生物工程研究所。Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號：556547)；活性氧測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：S0033S)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，南京固與生物有限公司，批號：GY22202)；Hoecgst33342細胞凋亡染色試劑(碧云天生物技術公司；批號：C1026)；Nrf2(批號：12721)NQO1(批號：62262S)HO-1(批號：43966)BAX(批號：5023)BCL-2(批號：3498)兔抗人單克隆抗體，二抗羊抗鼠IgG(批號：7076)羊抗兔IgG(批號：7074)；以上均購自Cell signaling公司。

1.4 實驗儀器

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司，型號：Agilent 6890NGC -5975MS)；倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司，型號：IXTIFL)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司，型號：FACSAria III)；Multiskan FC型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientifc)；7500Fast Real-Time PCR system(美國ABI公司)；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.5 EOSIR的提取與成分測定

1.5.1 EOSIR的提取 取姜葉三七干燥塊莖切碎，采用水蒸氣蒸餾法提取，收集得橘黃色揮發(fā)油，出油率為3.78%。

1.5.2 GC-MS聯(lián)用技術測定EOSIR成分 氣相色譜條件：VF-WAXMS(30 m×250 μm，1.0 μm)。采用程序升溫，初始溫度為50℃，以該溫度保持3分鐘，然后以4℃/min升溫至150℃，保持5分鐘，再以4℃/min升至235℃，保持10分鐘。載氣為高純度氮氣，載氣流量：1.0 mL/min，分流比100∶1。進樣口溫度：200℃。進樣量：0.5 μL。

質譜條件：EI電離：70 eV；離子源溫度：230℃，四極桿溫度：150℃。傳輸線溫度：230℃；掃描質量范圍m/z：40～550 amu。溶劑延遲：3.0分鐘。圖譜檢索庫為NIST2012年版標準質譜圖庫。

1.6 ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的建立

取對數(shù)生長期HUVECs按細胞密度為4×104個/mL接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24小時后，加入50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時或48小時后，采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。根據(jù)細胞存活率選取ox-LDL濃度為200 μg/mL，時間為24小時作為模型組的造模條件。

1.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的作用

細胞操作方法同1.6，貼壁培養(yǎng)24小時后分為4組：空白對照組、模型組、EOSIR給藥組、阿司匹林組?？瞻讓φ战M不加任何藥物處理，其余每孔加入200 μg/mL的ox-LDL繼續(xù)孵育24小時建立氧化損傷模型；棄掉損傷液，空白對照組和模型組加入完全培養(yǎng)液，其他組加入不同濃度的EOSIR(0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 μg/mL)和阿司匹林(0.05 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。

1.8 指標檢測

1.8.1 Hoechst33342染色試驗 取對數(shù)生長期的HUVECs按細胞密度為3×104個/mL接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)24小時后，分別用50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，接下來再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時，用4%多聚甲醛固定30分鐘，Hoechst 33342染色液室溫避光染色5分鐘，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8.2 ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞按2×105個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板，用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時，收集細胞培養(yǎng)基和細胞裂解液，采用ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量。實驗重復3次。

1.8.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時，給藥處理后每孔加入500 μL細胞培養(yǎng)液，再加入500 μL 的JC-1染色工作液，充分混勻，在培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細胞培養(yǎng)液，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8.4 活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量測定 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時，用0.25%胰酶消化細胞，收集到1.5 mL的EP管中；1000 r/min離心5分鐘，將細胞重懸于DCFH-DA中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘；用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次；用500 μL的PBS重懸細胞，過200目細胞篩，收集于流失管內(nèi)，上機檢測。實驗重復3次。

1.8.5 細胞凋亡的檢測 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后，收集貼壁細胞及漂浮細胞到1.5 mL的EP管中；1000 r/min離心5分鐘，用500 μL的1×Bingding buffer重懸細胞；加入5 μL Annexin-V混勻，再加入5 μL PI混勻；室溫靜置15分鐘，200目濾網(wǎng)過濾細胞，收集于流式管內(nèi)，上機檢測。實驗重復3次。

1.8.6 RT-qPCR檢測目的基因的mRNA表達水平 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時，再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后，用Trizol試劑提取總RNA，F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)SuperReal PreMix Plus試劑盒形成一個20 μL擴增體系，檢測Nrf2、HO1、NQO1、Bcl-2、Bax和GAPDHmRNA的表達。用GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA的相對表達量，并記錄數(shù)據(jù)。實驗重復3次。

1.8.7 WB法檢測目的基因蛋白表達水平的變化 提取蛋白質樣品后，根據(jù)蛋白質濃度確定樣品體積。用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳，然后恒流轉膜至PVDF膜上；將膜與二抗山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG-HRP在4℃孵育1小時。然后使用發(fā)光液對印跡進行顯影，并使用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行成像。實驗重復3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 EOSIR成分分析

采用GC-MS技術鑒定EOSIR中揮發(fā)性成分，用面積歸一化法測定百分含量，結果見表1。初步鑒定了54種成分，已鑒定揮發(fā)油成分占總揮發(fā)油含量為98.86%。其中含量最高的是莰烯，占22.38%；其次是α-蒎烯， 占16.11%；居第三位的是D-樟腦，占9.74%；第四位的是3,3,6,6-四甲基-3, 6, 7, 8-四氫化-并茚-1(2H)-酮，占8.41%。

表1 EOSIR成分分析

續(xù)表

2.2 EOSIR對正常的HUVECs的影響

EOSIR的濃度在小于等于60 μg/mL時，對正常HUVECs細胞的存活率沒有抑制，說明此濃度范圍的EOSIR對細胞沒有毒性。但當濃度大于等于80 μg/mL時，HUVECs細胞的存活率顯著性下降(P<0.01)，說明此濃度范圍的EOSIR對細胞有明顯的細胞毒性。見表2。

表2 不同濃度EOSIR對正常HUVECs細胞存活率的影響

2.3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

與空白對照組相比，隨著ox-LDL濃度和時間的增加，HUVECs的存活率明顯下降(P<0.01)。當ox-LDL濃度達到200 μg/mL時，24小時后細胞存活率下降至54.32%(P<0.01)，我們選擇細胞的半數(shù)致死量作為造模條件，故以此作為最佳造模條件。見表3。

表3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

2.4 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷存活率的影響

實驗結果提示，ox-LDL能明顯降低HUVECs細胞存活率(P<0.01);但當給藥EOSIR和阿司匹林后，均能顯著提高細胞的OD值和存活率(P<0.05或P<0.01)，其中，0.05 μg/mL的EOSIR將ox-LDL處理的HUVECs活力顯著提高(P<0.01)，表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的細胞存活率降低。見表4。

表4 MTT法分析EOSIR與阿司匹林對ox-LDL誘導HUVECs損傷的影響

根據(jù)實驗結果，接下來的實驗選擇EOSIR低、中、高劑量組分別為0.01、0.05、0.10 μg/mL。

2.5 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷LDH、MDA、NO、SOD、CAT、GSH-Px含量的影響

與空白對照組相比，模型組的LDH、MDA含量顯著增加(P<0.05或P<0.01)，NO、SOD、CAT和GSH-Px的含量顯著下降(P<0.01)。EOSIR處理的HUVECs中SOD活性顯著增加(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。其中0.1 μg/mL的EOSIR使CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。0.05 μg/mL的EOSIR使HUVECs中LDH釋放降低(P<0.01)，NO含量增加(P<0.01)，CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。見表5、表6、表7。

表5 EOSIR對HUVECs損傷LDH外漏量和MDA含量的影響

表6 EOSIR對HUVECs損傷NO和SOD含量的影響

表7 EOSIR對HUVECs損傷CAT和GSH-Px含量的影響

2.6 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

空白對照組中的HUVECs顯示出均勻的弱熒光。與空白對照組相比，ox-LDL在HUVECs中誘導了嚴重的功能障礙和細胞凋亡。細胞呈現(xiàn)強烈的藍色熒光，表明廣泛的核損傷和碎裂、細胞質濃縮和細胞體積迅速減少。相比之下，EOSIR和阿司匹林處理后，細胞藍色熒光強度不同程度下降，細胞形態(tài)逐漸恢復正常，核損傷減輕。見圖1。

圖1 各藥物對ox-LDL損傷的HUVECs保護作用形態(tài)學觀察

使用Annexin V-FITC/PI標記結合流式細胞術檢測EOSIR對ox-LDL誘導的HUVECs凋亡的影響。正常情況下內(nèi)皮細胞凋亡率約為11.73%，ox-LDL組內(nèi)皮細胞凋亡率較空白對照組為27.93。0.05 μg/mL EOSIR處理后細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)，表明EOSIR減少了ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡。見表8。

表8 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡率的影響

2.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

與空白對照組相比，200 μg/mL ox-LDL處理24小時使HUVECs內(nèi)ROS顯著增加(P<0.01)。當用0.05 μg/mL的EOSIR處理24小時后，ROS水平顯著降低(P<0.05)。見表9。

表9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞內(nèi)ROS的影響

2.8 EOSIR對HUVECs線粒體依賴性細胞凋亡的影響

空白對照組的MMP維持在正常水平，形成了以紅色熒光為主的JC-1聚合物。Ox-LDL處理HUVECs后，MMP降低并且形成具有增強的綠色熒光和減弱的紅色熒光的JC-1單體。在EOSIR處理的HUVECs中，綠色熒光強度降低，紅色熒光強度增加。此外，ox-LDL顯著降低Bcl-2 mRNA和蛋白質的表達(P<0.01)，并增加細胞中Bax mRNA和蛋白質的表達(P<0.01)。這種趨勢在EOSIR治療后被逆轉(P<0.05或P<0.01)。EOSIR通過增加Bcl-2 mRNA和蛋白質以及降低Bax mRNA和蛋白質發(fā)揮抗凋亡作用。見圖2，表10、表11。

表10 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

圖2 各藥物對ox-LDL損傷HUVECs線粒體膜電位的影響

表11 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

2.9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1和NQO1表達的影響

與空白對照組相比，ox-LDL導致Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA和蛋白質水平顯著降低(P<0.01)。用不同濃度的EOSIR和阿司匹林處理24小時后，Nrf2、NQO1和HO-1蛋白的表達增強(P<0.05或P<0.01)，表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的損傷。見表12、表13。

表12 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達的影響

表13 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響

3 討論

3.1 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用

ox-LDL是破壞血管內(nèi)皮細胞抗氧化和分泌活性功能，引起氧化應激、發(fā)生線粒體功能障礙，誘導內(nèi)皮細胞凋亡的主要危險因子，被認為是血管內(nèi)皮細胞損傷的重要危險因素[10-11]。本實驗中采用ox-LDL誘導HUVECs建立氧化損傷模型，然后給藥EOSIR，發(fā)現(xiàn)EOSIR給藥后能抑制ox-LDL誘導的細胞毒性，增加細胞存活率，并且相同濃度下的EOSIR對正常的HUVECs沒有細胞毒性。同時通過Hoechst 33242熒光染色發(fā)現(xiàn)ox-LDL作用HUVECs后出現(xiàn)明顯的細胞損傷形態(tài)學變化，細胞的體積變小，細胞呈濃縮致密的強藍色熒光。經(jīng)過EOSIR處理后細胞數(shù)量明顯增加，細胞藍色熒光強度減弱，細胞體積也恢復正常。表明EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用。

3.2 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

CAT和GSH-Px在維持細胞內(nèi)信號對氧化還原調節(jié)以及消除過氧化氫方面起著重要的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，當暴露于ox-LDL時HUVECs細胞脂質過氧化加劇，細胞膜受損，胞漿中的LDH就會迅速釋放到培養(yǎng)基中，同時ROS和MDA的含量顯著增加。相反，NO、SOD、CAT和GSH-Px的活性則顯著下降，這些結果與Geng等[14]的發(fā)現(xiàn)一致。當用EOSIR處理后，HUVECs中MDA的含量降低，NO的分泌增加，SOD、CAT和GSH-Px的含量也增加，并進一步降低了ROS的含量。這表明EOSIR通過清除自由基和增強抗氧化酶的活性來發(fā)揮抗氧化作用。同時，清除循環(huán)中的ROS和提高抗氧酶的活力是防止動脈粥樣硬化的關鍵[15-16]。

3.3 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

JC-1染色發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)的HUVECs表現(xiàn)出微弱的綠色熒光，以紅色熒光為主。經(jīng)ox-LDL誘導HUVECs細胞后出現(xiàn)綠色熒光增強、紅色熒光降低的現(xiàn)象，表現(xiàn)出線粒體膜電位的降低，這是線粒體損傷加重的一個重要指標[17-18]，與Liu等[19]觀察結果相一致。經(jīng)EOSIR處理后能夠逆轉線粒體膜電位的喪失，表明EOSIR能夠通過恢復線粒體膜電位來減少線粒體功能障礙，防止內(nèi)皮功能障礙。

另外，課題組發(fā)現(xiàn)ox-LDL能誘導HUVECs細胞凋亡數(shù)目的增加，同時能誘導HUVECs細胞中Bcl-2基因和蛋白表達的減少，以及Bax基因和蛋白表達的增加。當用不同濃度的EOSIR治療后可以逆轉這種變化，表明EOSIR可能通過抑制線粒體功能障礙相關的細胞凋亡信號通路來發(fā)揮保護作用。

3.4 EOSIR對Nrf2/ARE信號通路的影響

據(jù)文獻報道，許多植物化學物質可以通過上調Nrf2/ARE的激活來保護心血管的正常功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL作用于HUVECs后，細胞的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白表達顯著降低，用EOSIR處理后可上調游離Nrf2的mRNA和蛋白表達以及其下游靶基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達。表明EOSIR處理上調Nrf2核轉位及其下游靶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮其抗氧化損傷的作用。

綜合以上實驗結果，EOSIR具有對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的抗氧化和細胞保護作用。EOSIR能夠顯著抑制ox-LDL誘導HUVECs引起的氧化應激，抑制線粒體功能障礙引起的細胞凋亡，同時能夠激活Nrf2以及其下游的抗氧化蛋白酶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用。同時，以阿司匹林標準品作為陽性對照藥[21]，能更加可靠地說明EOSIR的療效，以及能清楚地反映EOSIR對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。該結果為EOSIR的藥理作用提供了科學的實驗依據(jù)，對豐富中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化方案有現(xiàn)實意義。