乳腺癌組織miR-92a、KLF4 mRNA的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系*

胡學(xué)麗，范先成

（長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳甲外科，湖南長(zhǎng)沙410005）

乳腺癌是女性最常見且病死率最高的惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)乳腺癌病例226.1 萬(wàn)，死亡68.5 萬(wàn)，我國(guó)新發(fā)乳腺癌病例41.6 萬(wàn)，死亡11.7 萬(wàn)，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。近年來乳腺癌的治療取得較大進(jìn)展，其預(yù)后相對(duì)肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等惡性腫瘤更好，但3%～10%的乳腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)存在轉(zhuǎn)移，30%早期乳腺癌可進(jìn)展為晚期乳腺癌，其5年生存率＜20%[2-3]。因此，有必要進(jìn)一步研究乳腺癌生物學(xué)和分子機(jī)制，識(shí)別乳腺癌新的治療靶點(diǎn)。miRNA 是一種單鏈非編碼內(nèi)源性RNA 分子，能調(diào)控靶基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。研究報(bào)道，miR-92a 在肝細(xì)胞癌、胃癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有關(guān)[5-6]。細(xì)胞周期調(diào)控異常、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤干細(xì)胞樣特性維持在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，KLF4 是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其參與調(diào)控細(xì)胞周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤干細(xì)胞樣特性等。有研究報(bào)道KLF4 參與卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤進(jìn)展[7-8]，且miR-92a、KLF4 mRNA 在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)[9-10]。本文探討miR-92a、KLF4在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2016年9月長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳甲外科收治的124 例乳腺癌患者。收集患者癌組織和距癌組織＞5 cm 的癌旁組織?；颊吣挲g32～72 歲，平均（50.54±8.68）歲；腫瘤直徑≥5 cm 有45 例，＜5 cm 有79 例；分化程度：低分化47 例，中高分化77 例；雌激素受體陽(yáng)性66 例，陰性58 例；孕激素受體陽(yáng)性74 例，陰性50 例；臨床分期[11]：Ⅰ、Ⅱ期83例，Ⅲ、Ⅳ期41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移80 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為乳腺癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③病理資料和隨訪資料完整；④患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②年齡＜18 歲；③嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾?。虎苋砀腥拘约膊?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

從液氮中取出50 mg 癌組織、癌旁組織研磨，使用Trizol 試劑盒提取總RNA，Narodrop 驗(yàn)證cDNA 濃度及純度，將OD260/OD280 調(diào)整為1.8～2.0，TaKaRa 試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。miR-92a 正向引物：5'-GATCTGGAT TGATATCAT-3'，反向引物：5'-TTCGAATGAGGACTA ATA-3'，分別為18 bp 和20 bp；KLF4 正向引物：5'-ATGGCTGGAATACATGCT-3'，反向引物 ：5'-ACTCGTAAGCCTGTGCAG-3'，分別為21 bp 和22 bp；miR-92a內(nèi)參U6正向引物：5'-TTACTGATTCGCTAGC AT-3'，反向引物：5'-CCGATTCTACGCTCGTGA-3'，分別為21 bp 和25 bp；KLF4 內(nèi)參GAPDH 正向引物：5'-GAGCCTTGAAGACTTGAT-3'，反向引物 ：5'-CTACGGACGACTCTGAAT-3'，分別為19 bp 和20 bp。反應(yīng)體系：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq，0.2 μL 引物，0.2 μL ROX 參考染料，1.0 μL cDNA 模板，3.4 μL 經(jīng)DEPC 處理水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪

患者出院后通過門診或電話隨訪5年，截止至2021年9月，隨訪終點(diǎn)為治療后至任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間或隨訪截止的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；多因素Cox 回歸模型分析患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-92a、KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量及其相關(guān)性

乳腺癌組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.627±0.436）和（2.270±0.569），癌旁組織分別為（1.007±0.192）和（1.104±0.144），癌組織和癌旁組織中miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.910 和21.227，均P=0.000），癌組織高于癌旁組織。Pearson 相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中miR-92a mRNA 與KLF4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.612，P=0.000）。見圖1。

圖1 相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），臨床分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-92a、KLF4 mRNA 表達(dá)水平高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。不同年齡、腫瘤直徑、分化程度、雌激素受體、孕激素受體患者miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 不同臨床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

臨床病理特征年齡≥50歲＜50歲腫瘤直徑≥5 cm＜5 cm分化程度低分化中、高分化n miR-92a mRNA t 值P 值KLF4 mRNA t 值P 值50 74 1.667±0.379 1.596±0.476 0.858 0.393 2.298±0.568 2.249±0.573 0.454 0.651 45 79 1.696±0.422 1.583±0.441 1.368 0.174 2.332±0.636 2.230±0.521 0.930 0.354 47 77 1.707±0.429 1.571±0.435 1.657 0.100 2.370±0.607 2.200±0.534 1.577 0.118

續(xù)表1

2.3 miR-92a、KLF4 mRNA 表達(dá)與乳腺癌患者生存率的關(guān)系

乳腺癌患者累積生存率為70.97%，以miR-92a、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均值（分別為1.627 和2.270）為基準(zhǔn)將患者分為高表達(dá)、低表達(dá)。高miR-92a 表達(dá)患者（55 例）和高KLF4 mRNA 表達(dá)患者（58例）的累積生存率分別為58.18%（32/55）、60.34%（35/58），低miR-92a 表達(dá)患者（69 例）、低KLF4mRNA 表達(dá)患者（66 例）分別為81.16%（56/69）、80.30%（53/66），經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.833、8.652，均P=0.003），高表達(dá)患者低于低表達(dá)患者。見圖2。

圖2 高、低miR-92a、KLF4 mRNA表達(dá)乳腺癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 乳腺癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析

以低分化腫瘤（是=1，否=0）、臨床分期Ⅲ、Ⅳ期（是=1，否=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、miR-92a（≥1.627= 1，＜1.627=0）和KLF4 mRNA（≥2.270=1，＜2.270= 0）作為自變量，以是否死亡作為因變量（是=1，否=0），進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期[=3.716（95% CI：1.765，7.826）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=3.021（95% CI：1.341，6.803）]、miR-92a mRNA 相對(duì)表達(dá)量≥1.627 [=3.401（95% CI：1.358，8.515）]、KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量≥2.270 [=2.059（95% CI：1.026，4.133）]是乳腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

乳腺癌主要由乳腺上皮細(xì)胞增殖失控進(jìn)而惡變形成，是嚴(yán)重影響女性身心健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與多種基因異常表達(dá)密切相關(guān)，近年來手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療等多學(xué)科綜合治療策略極大地改善了患者的預(yù)后，但晚期乳腺癌仍然難以治愈[3]。同時(shí)放療作為降低保乳手術(shù)和高危乳房切除患者復(fù)發(fā)和延長(zhǎng)生存期的重要手段，在治療過程中也易出現(xiàn)獲得性抵抗，導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[12]。腫瘤是多基因、多機(jī)制共同參與的復(fù)雜過程，近年來分子生物學(xué)發(fā)展為腫瘤治療提供了新的途徑，但乳腺癌在基因水平上的治療仍然缺乏有力證據(jù)，有必要進(jìn)一步探索乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)機(jī)制，對(duì)完善乳腺癌治療策略和評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后具有重要意義。

miRNA 是一類內(nèi)源性長(zhǎng)約18～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可在3'-非翻譯區(qū)與靶基因的mRNA 結(jié)合，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，在包括乳腺癌在內(nèi)多種腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能[4]。如miR-370-5p 能靶向下調(diào)LUC7 樣3 前體剪接因子抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[13]。miR-92a 為高度保守的miR-17-92 基因簇一員，位于人染色體13q31.3。近年研究表明其參與多種惡性腫瘤進(jìn)展，如ZHENG 等[14]報(bào)道，miR-92a 在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，能通過調(diào)控第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/蛋白激酶B 信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。WANG 等[15]研究報(bào)道，miR-92a 在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，其通過下調(diào)磷脂酰肌醇-3 激酶調(diào)節(jié)亞基1 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-92a 表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其機(jī)制可能與miR-92a 能靶向抑制BTG2。BTG2是BTG/TOB 基因家族一員，作為腫瘤抑制因子參與癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為，能通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 等信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展[16]。HUANG 等[17]研究報(bào)道，miR-92a 能靶向抑制BTG2 表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，與低miR-92a mRNA 表達(dá)患者比較，高miR-92a mRNA 表達(dá)患者生存率顯著降低，多因素Cox 回歸也顯示，miR-92a mRNA 相對(duì)表達(dá)量≥1.627患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加3.401 倍，說明miR-92a mRNA表達(dá)上調(diào)與乳腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，可能成為評(píng)估乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物。

鋅指蛋白是人體最大的轉(zhuǎn)錄家族，其促癌或抑癌作用參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展[18]。KLF4 是一種含鋅指修飾結(jié)構(gòu)的蛋白，可通過結(jié)合CACCC 元件和其他DNA 序列調(diào)節(jié)基因表達(dá)，由于KLF4 具備轉(zhuǎn)錄抑制和激活2 種結(jié)構(gòu)域，因此可以正向或負(fù)向調(diào)節(jié)下游靶基因，在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮促癌或抑癌作用。如KLF4 mRNA 在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)KLF4 mRNA 表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19]。但在非霍奇金淋巴瘤中，KLF4 mRNA 表達(dá)上調(diào)與非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞化療抗性、遷移和生存率降低密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中KLF4 表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明KLF4 表達(dá)升高與乳腺癌惡性進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制可能與KLF4 能通過維持腫瘤干細(xì)胞樣特性有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞具備自我復(fù)制和多細(xì)胞分化等能力，是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞。目前研究認(rèn)為，KLF4 的抑癌作用主要與KLF4 能抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，而促癌作用與其能通過維持正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的端粒酶活性，進(jìn)而維持腫瘤干細(xì)胞樣特性有關(guān)[21-22]。近年多項(xiàng)研究也顯示，抑制KLF4 表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特征，增強(qiáng)藥物治療作用[23-24]。本研究結(jié)果顯示，與低KLF4 mRNA 表達(dá)患者比較，高KLF4 mRNA 表達(dá)患者生存率顯著降低，多因素Cox 回歸也顯示，KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量≥2.270 患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加2.059倍，說明KLF4 mRNA 表達(dá)上調(diào)與乳腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，也可能成為評(píng)估乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物。本研究結(jié)果還顯示，乳腺癌組織中miR-92a與KLF4 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，說明miR-92a 與KLF4 共同參與了乳腺癌惡性進(jìn)展，可能與KLF4 為miR-92a 的下游調(diào)控靶點(diǎn)有關(guān)。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-92a、KLF4 mRNA 高表達(dá)，與臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究樣本量較少，未從細(xì)胞學(xué)上分析miR-92a，KLF4 對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，還有待進(jìn)一步研究。