RasGRF1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

王碩，楊其賢，殷旭薇，孫穎昕

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213004）

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，尚未明確。目前臨床治療結(jié)直腸癌主要通過(guò)手術(shù)及放化療，由于其惡性程度高，患者5年生存率僅為50%左右[1-2]。從基因?qū)用嫣綄そY(jié)直腸癌分子生物學(xué)治療靶標(biāo)以改善患者預(yù)后成為研究熱點(diǎn)。RasGRF1是一種父系印記基因，位于人染色體25q15 上，能夠調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)展[3]。何新等[4]研究顯示，抑制RasGRF1 表達(dá)能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前RasGRF1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響的具體機(jī)制尚未明確。隋華等[5]研究顯示，抑制PI3K/Akt 通路活化，能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高化療敏感性。目前RasGRF1 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響是否與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關(guān)少見報(bào)道，故本研究探究RasGRF1 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并分析其對(duì)PI3K/Akt 通路的影響，以期為臨床治療結(jié)直腸癌提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞均由廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM-H 培養(yǎng)基（北京伊塔生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）（廣州蕊特生物科技有限公司），Lipo-fectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），si-RasGRF1、si-RasGRF1-NC序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，CCK-8 試劑盒（深圳市紐邦生物技術(shù)有限公司），Annexin V/PITC 雙染試劑盒（上海復(fù)申生物科技有限公司），兔抗人Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（武漢亞科因生物技術(shù)有限公司）。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），C1000 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），CytoFLEX SRT 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇并解凍DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞，置于含10% 滅活FBS＋DMEM-H 的培養(yǎng)液，在37℃、5%二氧化碳2、95%氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 天換1 次培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。

1.3.2 根據(jù)RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量篩選細(xì)胞系分別取1.3.1 中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞，并提取總RNA、測(cè)濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系20 μL：ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應(yīng)條件：95℃變性15 s，60℃退火60 s，共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線：60℃至95℃，每15 秒升溫0.3℃。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3.3 細(xì)胞分組及處理1.3.2 結(jié)果顯示DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量最高，選其為研究對(duì)象。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DiFi 細(xì)胞，按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%，更換無(wú)FBS 培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī)分為3 組。用無(wú)FBS 的培養(yǎng)液將LipofectamineTM3000 稀釋并分別配制濃度為10 mmol/L 的si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1，然后將等體積LipofectamineTM3000 分別與si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1 混勻、靜置，加入DiFi 細(xì)胞中，分別作為si-RasGRF1-NC 組（陰性對(duì)照）、si-RasGRF1 組（沉默RasGRF1 表達(dá)）。同時(shí)將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)置為NG組（空白對(duì)照）。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)RasGRF1 mRNA 的表達(dá)分別取各組DiFi 細(xì)胞并提取總RNA、測(cè)濃度，參照1.3.2 的方法，計(jì)算各組DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活情況分別取各組DiFi 細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理，將細(xì)胞按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各孔細(xì)胞光密度（optic density， OD）值，重復(fù)3 次，嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞OD 值，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 AnnexinV/PITC 雙染法檢測(cè)DiFi 細(xì)胞凋亡分別取各組DiFi 細(xì)胞，PBS 溶液洗滌，棄上清液，調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，取100 μL 加入AnnexinV/PITC（5 μL）+PI（10 μL，20 μg/mL）混勻，孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的表達(dá)分別取各組DiFi 細(xì)胞，以RIPA 裂解并提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，放入5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，分別加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3 及內(nèi)參β-actin 作為一抗（1∶500 稀釋），4℃過(guò)夜，加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，顯影、定影，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中RasGRF1 mRNA 的表達(dá)

DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.15）、（0.69±0.11）、（0.73±0.12）、（0.45±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=222.059，P=0.005），DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量最高（P＜0.05），選擇DiFi 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組DiFi 細(xì)胞RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組RasGRF1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.15）、（0.99±0.16）和（0.71±0.11），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=324.568，P=0.000），si-RasGRF1 組低于NG 組和si-RasGRF1-NC 組（P＜0.05），說(shuō)明DiFi 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

2.3 抑制RasGRF1 表達(dá)對(duì)DiFi 細(xì)胞存活能力的影響

NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組DiFi細(xì)胞OD 值分別為（0.87±0.15）、（0.85±0.13）和（0.37±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 883.063，P=0.000），si-RasGRF1 組低于NG 組和si-RasGRF1-NC 組（P＜0.05）。

2.4 抑制RasGRF1表達(dá)對(duì)DiFi細(xì)胞凋亡的影響

NG 組、si-RasGRF1-NC 組、si-RasGRF1 組DiFi細(xì)胞凋亡率分別為（9.15±1.38）%、（9.03±1.36）%和（25.78±3.87）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=396.215，P=0.000），si-RasGRF1 組高于NG 組和si-RasGRF1-NC 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組DiFi細(xì)胞流式細(xì)胞圖

2.5 抑制RasGRF1 表達(dá)對(duì)DiFi 細(xì)胞PI3K/Akt 通路蛋白的影響

NG 組、 si-RasGRF1-NC 組、 si-RasGRF1 組DiFi 細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：si-RasGRF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NG組和si-RasGRF1-NC 組（P＜0.05），Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NG 組和si-RasGRF1-NC 組（P＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組DiFi細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與NG組、si-RasGRF1-NC組比較，P ＜0.05。

組別NG組si-RasGRF1-NC組si-RasGRF1組F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 0.40±0.08 0.97±0.16?261.329 0.000 p-PI3K/PI3K 1.08±0.17 1.06±0.16 0.45±0.08?324.015 0.000 p-Akt/Akt 1.15±0.18 1.17±0.18 0.51±0.08?331.5241 0.000

3 討論

結(jié)直腸癌是惡性程度較高的消化道腫瘤之一，發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第三位，目前臨床治療仍以手術(shù)輔以放化療為主，但未能取得較理想的療效[6]。RasGRF1 是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，參與腫瘤進(jìn)展[7]。聶文靜等[8]研究顯示，RasGRF1在結(jié)直腸癌組織中異常高表達(dá)，作為促癌基因參與結(jié)直腸癌進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道，下調(diào)RasGRF1 表達(dá)能對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。

腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵，其中Caspase-3 是凋亡過(guò)程的關(guān)鍵執(zhí)行者[9-10]。本研究選擇DiFi 細(xì)胞進(jìn)行研究，成功轉(zhuǎn)染DiFi 細(xì)胞，且結(jié)果顯示，與NG 組、si-RasGRF1-NC 組比較，si-RasGRF1 組DiFi 細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高。與既往研究結(jié)果一致，說(shuō)明抑制RasGRF1 表達(dá)能夠抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PI3K 是PI3K/Akt 信號(hào)通路的起始因子，其活化產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)而磷酸化Akt 蛋白的Thr308位點(diǎn)，促使Akt 活化；而活化的Akt 發(fā)生磷酸化，最終抑制下游靶基因Caspase-3 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[11-13]。馬家馳等[14]研究顯示，抑制PI3K/Akt 通路活化能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。既往研究顯示，上調(diào)RasGRF1 表達(dá)能促進(jìn)Ras-PI3K-Akt 通路活化，參與腫瘤成纖維細(xì)胞增殖及分化[15]。本研究結(jié)果顯示，與NG 組、si-RasGRF1-NC 組比較，psi-RasGRF1組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，說(shuō)明抑制RasGRF1表達(dá)能抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，RasGRF1 在人結(jié)直腸癌DiFi 細(xì)胞中異常高表達(dá)。抑制RasGRF1 表達(dá)可能抑制PI3K/Akt通路活化，從而抑制DiFi 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而本實(shí)驗(yàn)未能明確RasGRF1 對(duì)PI3K/Akt 通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入研究。