IFITM1在胰腺癌中的表達及對胰腺癌細胞生物學行為的影響

趙秀雷，張雷，劉汝海，李鳳山，張執(zhí)全，孔德帥，張耀敏，石倩倩，劉婷婷

（河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科，河北滄州061000）

統(tǒng)計報告顯示，全世界每年新增胰腺癌患者約46萬例，死于胰腺癌的患者約為43萬例，分別占所有惡性腫瘤的2.5%和4.5%，每年新發(fā)胰腺癌患者的比例雖然排在所有惡性腫瘤的第14位，但其病死率卻排在第7位，并且近年來胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，總體發(fā)病年齡呈下降趨勢[1-3]。胰腺癌早期診斷困難，接近一半的患者在確診時已處于晚期[4-5]。雖然不斷有新的靶向藥物、免疫藥物被應用于臨床，但是胰腺癌患者的5年生存率仍不足10%[6]。胰腺癌的轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致治療失敗和患者死亡的重要因素，但其機制尚不清楚[7]?，F(xiàn)階段研究[8-10]表明，作為MAPK通路的核心激酶，ERK1/2的磷酸化激活會顯著促進下游增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，ERK1/2的激活是導致胰腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素，調(diào)控ERK1/2則是治療胰腺癌的重要思路。干擾素誘導的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1）是一種分子量為17 kDa的膜蛋白，是在淋巴細胞中轉(zhuǎn)導同型黏附信號的膜復合物的一部分[11-13]。一項測序研究[14]結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFITM1的轉(zhuǎn)錄水平在胰腺癌組織中顯著升高，但是IFITM1蛋白在胰腺癌中的意義以及作用機制則仍不清楚。綜上，本研究主要分析IFITM1、ERK1/2在胰腺癌中的表達特點，并分析IFITM1調(diào)控胰腺癌細胞遷移和侵襲的分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2018年6月—2021年6月間在河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科行手術(shù)治療的78例胰腺癌患者，收集患者手術(shù)切除的胰腺癌組織和癌旁正常組織（距腫瘤組織3 cm以上）。其中男47例，女31例；年齡41～74歲。根據(jù)全身正電子發(fā)射計算機斷層顯像（positron emission tomographycomputed tomography，PET-CT）的結(jié)果，將患者分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組。未轉(zhuǎn)移組患者46例，男28例，女18例；平均年齡（53.25±3.62）歲。轉(zhuǎn)移組共32例，男19例，女13例；平均年齡（54.42±3.79）歲。納入標準：⑴年齡在40～75歲之間；⑵確診為胰腺癌；⑶患者知情同意。排除標準：⑴收集前3個月內(nèi)接受過胰腺癌相關(guān)治療；⑵合并血液學疾病、感染或炎癥；⑶合并其他癌癥。本研究經(jīng)過河北省滄州市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 材料

人胰腺癌細胞PANC-1（ATCC，美國）。96孔、24孔組織培養(yǎng)板（康寧公司，美國）。RPMI 1640培養(yǎng)基和抗體（Gibco公司，美國）。IFITM1過表達質(zhì)粒以及相應的陰性對照（negative control，NC）（吉瑪公司，中國）。Lipofectamine?2000（Invitrogen公司，美國）。選擇性ERK1/2抑制劑LY3214996（Selleck公司，美國）?？贵w（Abcam公司，美國）。PDVF膜（Millipore公司，美國）。ECL顯色試劑盒和Nanodrop 2000儀器（Thermo Fisher公司，美國）。凋亡試劑盒（Annexin V-FITC和PI）（耶森公司，中國）。流式細胞儀（Becton公司，美國）。基質(zhì)膠和Transwell裝置（Corning公司，美國）。光學顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.3 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細胞PANC-1培養(yǎng)在RPMI1640完全基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃和95%濕度下培養(yǎng)。細胞分為3組：對照組、IFITM1組、IFITM1+LY3214996組。IFITM1組和IFITM1+LY3214996組細胞通過轉(zhuǎn)染IFITM質(zhì)粒來過表達IFITM1。將細胞在6孔板中培養(yǎng)，當細胞達到60%匯合后，添加Opti（100μL）和LipofectamineTM2000（5μL）并孵育5 min作為試劑A。加入Opti（100μL）和IFITM1質(zhì)粒（20 ng/μL）并孵育5 min作為試劑B。將A和B混合在一起并孵育20 min。16 h后，更換培養(yǎng)基并收獲細胞。對照組細胞轉(zhuǎn)染等量的NC作為對照。IFITM1+LY3214996組的細胞在培養(yǎng)基中加入終濃度為10 nmol/L ERK1/2通路抑制劑LY3214996。

1.4 檢測方法

1.4.1 Western blot對于組織中的蛋白水平，按照分組將等量的組織一起裂解。組織或者細胞裂解后通過離心（4℃，12 000 r/min，5 min）收集總蛋白。通過10%的SDS-PAGE分離40μg的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。加入5%脫脂牛奶（室溫，2 h）封閉后加入一抗（1∶1 000稀釋，4°C，8 h），洗滌后加入二抗（1∶2 000稀釋，室溫，1 h）。條帶利用ECL可視化處理，GAPDH作為內(nèi)參，分析ERK1/2和p-ERK1/2的相對表達量。

1.4.2 CCK-8檢測細胞增殖活力將100μL的細胞懸浮液添加到96孔板的孔中，孵育24 h和48 h后，將體積為10μL的CCK-8溶液添加到每個孔中并孵育2 h。在450 nm波長下，用酶標儀檢測每個孔的光密度（OD）值。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測凋亡將細胞用1×PBS洗滌并懸浮在100μL結(jié)合緩沖液中。加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI，在室溫下于黑暗中孵育10～15 min。最后，將400μL的結(jié)合緩沖液添加到樣品中，并在1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.4 劃痕愈合實驗檢測遷移按照上述方法在6孔板中培養(yǎng)細胞，形成單層細胞。然后使用200μL塑料移液器吸頭進行劃痕。在0 h的劃痕寬度。倒出培養(yǎng)基，洗去劃掉的細胞，然后將細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。再次拍照以評估劃痕的愈合情況。通過光學顯微鏡測量劃痕前緣遷移距離百分比。。

1.4.5 Transwell檢測侵襲將基質(zhì)膠（1∶8稀釋）加入Transwell裝置的上室并在37°C下孵育30 min。將600μL完全培養(yǎng)基填充到4孔板-Transwell裝置的下室。將細胞在無血清培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)24 h進行饑餓處理。消化后，向水合的Transwell上室中加入100μL細胞溶液（5×105個細胞/mL）。24 h后，洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。在×400倍視野中的5個隨機視野中計數(shù)細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，兩組間的比較通過t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中IFITM1的表達特點

IFITM1在胰腺癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁正常組織（3.85±0.34vs.1.00±0.08，P＜0.001）（圖1A）。IFITM1在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的相對表達量明顯高于未轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織（4.04±0.19vs.2.00±0.11，P=0.007）（圖1B）。

圖1 Western blot檢測IFITM 1蛋白表達A：胰腺癌組織與癌旁正常組織；B：有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織與無轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織Figure1 IFITM1 protein expressions detected by Western blot analysis A:Pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissue;B:Pancreatic cancer tissueswith and without metastasis

2.2 各組細胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平比較

各組細胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。IFITM1組的IFITM1和p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯高于對照組（P＜0.001）。IFITM1+LY3214996組的p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯低于IFITM1組（P＜0.001），但IFITM1水平與IFITM1組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。IFITM1+LY3214996組的IFITM1蛋白水平明顯高于對照組（P＜0.001），p-ERK1/2/ERK1/2水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組細胞中IFITM 1蛋白和ERK 1/2蛋白磷酸化水平Figure 2 The levels of IFITM1 protein and phosphorylation ERK 1/2 protein in each group of cells

2.3 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞增殖活力的影響

各組細胞增殖活力差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IFITM1組的24、48 h的細胞增殖活力均明顯高于對照組（均P＜0.001）；IFITM1+LY3214996組24、48 h的細胞增殖活力均明顯低于IFITM1組（均P＜0.001）；IFITM1+LY3214996組與對照組間24、48 h的細胞增殖活力差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 CCK-8法檢測各組胰腺癌細胞的增殖活力（OD值）Figure 3 Theproliferativeability of each group of pancreatic cancer cellsdetected by CCK-8 assay(OD value)

2.4 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞凋亡的影響

各組細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（F=16.1578，P=0.004）。IFITM1組的凋亡率明顯低于對照組[（3.86±0.41）%vs.（6.01±0.58）%，P=0.014]；IFITM1+LY3214996組的凋亡率明顯高于IFITM1組[（5.67±0.63）%vs.（3.86±0.41）%，P=0.027]；IFITM1+LY3214996組與對照組的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義[（5.67±0.63）%vs.（6.01±0.58）%，P＞0.05]（圖4）。

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組胰腺癌細胞凋亡情況Figure4 Theapoptosisin each group of pancreatic cancer cellsdetected by flow cytometry

2.5 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞遷移的影響

各組細胞遷移能力差異有統(tǒng)計學意義（F=23.715，P＜0.001）。IFITM1組的劃痕前緣遷移百分比明顯高于對照組[（86.23±4.61）%vs.（51.78±2.64）%，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組的劃痕前緣遷移百分比明顯低于IFITM1組[（48.82±3.12）%vs.（86.23±4.61）%，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組與對照組劃痕前緣遷移百分比差異無統(tǒng)計學意義[（48.82±3.12）%vs.（51.78±2.64）%，P＞0.05]（圖5）。

圖5 劃痕愈合實驗檢測各組胰腺癌細胞的遷移能力Figure 5 The migration ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by scratch healing experiment

2.6 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞侵襲的影響

3組細胞侵襲能力差異有統(tǒng)計學意義（F=36.286，P＜0.001）。IFITM1組的侵襲細胞數(shù)目明顯高于對照組[（210.85±15.43）個vs.（104.47±10.86）個，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組的侵襲細胞數(shù)目明顯低于IFITM1組[（112.35±14.94）個vs.（210.85±15.43）個，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組與對照組的侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義[（112.35±14.94）個vs.（104.47±10.86）個，P＞0.05]（圖6）。

圖6 Transwell實驗檢測各組胰腺癌細胞的侵襲能力Figure 6 The invasion ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by Transwell assay

3 討論

IFITM1是一種由干擾素誘導的蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、運動和分泌的作用[15-17]。近年來研究[18-20]表明IFITM1在喉癌、胰腺癌等中發(fā)揮促癌作用。Sakamoto等[21]的研究結(jié)果表明，IFITM1可參與細胞黏附和增殖的多聚體復合蛋白，IFITM1在肺癌組織中過表達并且促進肺癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移。也有研究顯示IFITM1是膽囊癌轉(zhuǎn)移的標志因子[22]。為分析IFITM1在胰腺癌中的意義，本研究在臨床上收集了胰腺癌組織和癌旁正常組織，結(jié)果顯示IFITM1在胰腺癌組織中顯著過表達。此外，根據(jù)腫瘤轉(zhuǎn)移情況分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，結(jié)果顯示出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的IFITM1蛋白水平顯著高于未轉(zhuǎn)移組。為進一步分析IFITM1對胰腺癌細胞的影響，本研究通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建了IFITM1過表達的胰腺癌細胞模型，結(jié)果顯示提高IFITM1的水平會促進細胞的增殖、遷移和侵襲的能力，并抑制凋亡。本研究結(jié)果提示IFITM1與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，IFITM1可促進胰腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移來促進胰腺癌進展。

為進一步分析IFITM1促進胰腺癌進展的機制，本研究也檢測了IFITM1對胰腺癌細胞中ERK1/2的影響。一項研究[23]顯示IFITM1可通過調(diào)節(jié)ERK1/2的激活參與人類矮小癥的發(fā)生。也有研究[24-25]顯示IFITM1的配體干擾素-γ可通過促進ERK1/2的磷酸化激活促進腫瘤細胞的免疫逃逸，從而促進肺癌進展。ERK1/2蛋白已被證明參與胚胎發(fā)育、器官發(fā)生以及多種生理過程，包括、代謝、細胞周期、免疫等[26-27]。研究[28-30]顯示ERK1/2被磷酸化激活后會促進細胞周期、細胞運動和抗凋亡蛋白的表達，進而參與胰腺癌的發(fā)生和進展。本次研究結(jié)果顯示IFITM1蛋白的水平升高后，胰腺癌細胞中的ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高。此外，本研究也進行了挽救實驗，即利用ERK1/2抑制劑LY3214996來阻斷ERK1/2的激活。結(jié)果顯示抑制ERK1/2的激活可顯著的阻斷IFITM1對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用，并降低IFITM1的抗凋亡作用。根據(jù)文獻，本研究結(jié)果說明IFITM1促進胰腺癌的作用與ERK1/2密切相關(guān)。

然而，本研究也存在不足之處，關(guān)于IFITM1與胰腺癌患者生存率之間的關(guān)系仍需要擴大樣本進行長期隨訪研究。此外，IFITM1通過ERK1/2促進胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制仍需要動物實驗證實。

綜上所述，IFITM1促進胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，IFITM1在胰腺癌組織中上調(diào)并可通過激活ERK1/2促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。提示IFITM1可能成為診斷和治療胰腺癌的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。