長(zhǎng)鏈非編碼RNA SOX21-AS1調(diào)控miR-31-5p/MMP-16軸對(duì)胰腺癌細(xì)胞活性與增殖的影響

臧龍軍，陳東杰，高文哲，黃琿，朱紅偉，余梟

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院肝膽胰II外科，湖南長(zhǎng)沙410013）

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，是全球第12位常見惡性腫瘤[1]，也是癌癥死亡的第七大原因；在我國，2003—2013年居民癌癥數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第10位；其中胰腺導(dǎo)管腺癌的病死率在所有惡性腫瘤中位列第5位，5年相對(duì)生存率在常見惡性腫瘤中最差，僅為7.2%，且呈逐年惡化的趨勢(shì)[2]。胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)后即處于局部進(jìn)展期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移期，可手術(shù)切除率低，超過80%患者會(huì)在手術(shù)切除后復(fù)發(fā)[3]，預(yù)后極差。而現(xiàn)階段仍缺乏針對(duì)中晚期侵襲性胰腺癌的治療手段，因此深入了解胰腺癌的分子病理學(xué)機(jī)制才能有助于開發(fā)高特異度、高效的靶向治療藥物[4]。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是不進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA，其中包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）。lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，是腫瘤進(jìn)展中重要的調(diào)節(jié)因子，參與了包括增殖、遷移、分化、凋亡等眾多細(xì)胞事件。此外，它還參與各種細(xì)胞過程，并通過與miRNA、mRNA相互作用等多種機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[5-8]。有研究報(bào)道lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]，lncRNA LINC00261的上調(diào)能明顯抑制胰腺癌在體內(nèi)及體外的細(xì)胞增殖和遷移[10]，lncRNA TP73-AS1通過miRNA-128-3p/GOLM1軸促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。除此，對(duì)胰腺癌有影響的lncRNA還有BCAR4[12]、RP11-567G11.1[13]、CASC2[14]。

SOX21-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種位于人類13號(hào)染色體上長(zhǎng)3 230 bp的lncRNA，為SOX21的反義基因，它與眾多惡性腫瘤關(guān)系密切，研究表明SOX21-AS1影響肺腺癌侵襲和遷移[15]及宮頸癌病程的進(jìn)展[16]。但目前SOX21-AS1在胰腺癌中的作用暫不明確。本研究旨在探索SOX21-AS1在胰腺癌病程發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用及機(jī)制，以期對(duì)提高臨床的診治及改善預(yù)后發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

5種胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990）和人胰管上皮細(xì)胞系HPDE由美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。所有細(xì)胞都在RPMI1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific），在37℃、5%CO2加濕環(huán)境中培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。靶向SOX21-AS1的兩種siRNA購自ABC（Abcam，Cambridge，MA，USA）；miR-31-5p模擬物和miR-31-5p抑制劑購自Genechem（中國上海）。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析

通過TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從組織或細(xì)胞中提取總RNA。用PARIS試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)來源的RNA。使用SYBR PCR試劑盒（德泰生物，中國南京）對(duì)SOX21-AS1和MMP-16 mRNA進(jìn)行定量。使用NCode miRNA qRT-PCR分析評(píng)估m(xù)iR-31-5p的表達(dá)水平。以GAPDH的表達(dá)水平為對(duì)照對(duì)SOX21-AS1的表達(dá)水平做標(biāo)準(zhǔn)化。將miR-31-5p的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照U6。本研究所使用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-31-5p模擬物，miR-31-5p抑制物及其陰性對(duì)照購自RiboBio（中國廣州）。為了抑制SOX21-AS1的表達(dá)，在U6/GFP/Neo質(zhì)粒（GenePharma，中國上海）中構(gòu)建了針對(duì)SOX21-AS1的siRNA序列（si-SOX21-AS1#1和si-SOX21-AS1#2），以攜帶非靶向序列的質(zhì)粒被用作對(duì)照。使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，使用含有0.5 mg/mL G418的培養(yǎng)基（美國密蘇里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本研究中使用的所有引物均來自Genechem（中國上海）。轉(zhuǎn)染所使用的miRNA及siRNA序列見表2。

表2 miRNA與siRNA序列Table 2 ThemiRNAand siRNAsequences

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

使用pmirGLO熒光素酶表達(dá)載體（Promega，美國）構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒。通過從SOX21-AS1插入包含預(yù)測(cè)的miR-31-5p結(jié)合位點(diǎn)的片段，克隆了野生型SOX21-AS1（SOX21-AS1-WT）質(zhì)粒。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，可以創(chuàng)建一個(gè)SOX21-AS1基因突變質(zhì)粒（SOX21-AS1-MT）。將HEK293T細(xì)胞鋪在6孔板中，并用含有SOX21-AS1-WT或SOX21-AS1-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對(duì)照的熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染。通過從miR-31-5p插入包含預(yù)測(cè)的MMP-16結(jié)合位點(diǎn)的片段，克隆了野生型MMP-16質(zhì)粒（MMP-16-WT）。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，可以創(chuàng)建一個(gè)MMP-16基因突變質(zhì)粒（MMP-16-MT）。將HEK293T細(xì)胞鋪在6孔板中，并用含有MMP-16-WT或MMP-16-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對(duì)照的熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染。48 h后測(cè)定熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞活力測(cè)定

使用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。將轉(zhuǎn)染的PANC-1或SW1990細(xì)胞接種在96孔板中，并在不同時(shí)間點(diǎn)（接種后1、2、3、4、5 d）測(cè)量細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)而言之，將MTT溶液（20μL，Sigma-Aldrich）添加到細(xì)胞中4 h，除去培養(yǎng)基，然后添加二甲基亞砜。使用Quant Universal Microplate分光光度計(jì)（BioTek，Winooski，VT，美國）測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.6 集落形成試驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞添加到6孔板（500個(gè)細(xì)胞/孔）中。2周后，將細(xì)胞固定，染色，然后成像并使用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并使用Student'st檢驗(yàn)和單向方差分析進(jìn)行評(píng)估。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX21-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響

在使用qRT-PCR對(duì)20例胰腺癌患者的胰腺癌組織和匹配的鄰近癌旁組織中的SOX21-AS1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后，結(jié)果顯示，SOX21-AS1在胰腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.01）（圖1A）。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與癌旁組織HPDE相比，胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990中SOX21-AS1表達(dá)均升高（均P＜0.05），其中SOX21-AS1在BXPC3、SW1990細(xì)胞中的表達(dá)高于其他細(xì)胞株，因此選用胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)敲低實(shí)驗(yàn)（圖1B）。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，SOX21-AS1高表達(dá)患者較其低表達(dá)患者預(yù)后差（P＜0.05）（圖1C），表明SOX21-AS1可能與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度密切相關(guān)。

圖1 胰腺癌中SOX21-AS1的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響A：qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)胰腺癌標(biāo)本和鄰近正常組織中SOX21-AS1的表達(dá)量；B：qRT-PCR檢測(cè)不同胰腺癌細(xì)胞系與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中SOX21-AS1表達(dá)量；C：TCGA生物學(xué)數(shù)據(jù)庫分析SOX21-AS1表達(dá)對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的影響Figure 1 Expression of SOX21-AS1 in pancreatic cancer and its association with the prognosis A:Relative expression of SOX21-AS1 detected by qRT-PCR in 20 cancer tissues and matched normal tissues;B:qRT-PCR analysis of the relative expression of SOX21-AS1 in pancreatic cell lines and normal pancreatic duct epithelial cell line;C:Influence of SOX21-AS1 on prognosisof pancreatic cancer patientsby TCGAanalysis

2.2 沉默SOX21-AS1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力及增殖的影響

由于SOX21-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步使用功能喪失實(shí)驗(yàn)來確定其是否影響胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力及增殖水平。在使用靶向SOX21-AS1的兩種特定的siRNA轉(zhuǎn)染BXPC3、SW1990細(xì)胞后，qRT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組（si-NC）比較，BXPC3和SW1990細(xì)胞中，si-SOX21-AS1#1組與si-SOX21-AS1#2組中SOX21-AS1表達(dá)均降低（均P＜0.05）（圖2A），表明轉(zhuǎn)染后SOX21-AS1表達(dá)沉默，提示轉(zhuǎn)染成功（且si-SOX21-AS1#1組中的沉默效果更明顯，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該組siRNA進(jìn)行沉默）。隨后，通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BXPC3和SW1990細(xì)胞中si-SOX21-AS1#1組的細(xì)胞活力均較各自si-NC組明顯降低（均P＜0.05）（圖2B）。此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BXPC3和SW1990細(xì)胞中，si-SOX21-AS1#1組細(xì)胞增殖水平相較于si-NC組明顯下降（均P＜0.05）（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明，沉默SOX21-AS1的表達(dá)降低了胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖水平。

圖2 SOX21-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力、增殖的影響A：qRT-PCR檢測(cè)SOX21-AS1沉默后胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞中SOX21-AS1表達(dá)量；B：MTT檢測(cè)BXPC3與SW1990細(xì)胞的活力；C：細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BXPC3和SW1990細(xì)胞的增殖能力Figure 2 Effect of SOX21-AS1 on viability and proliferation of pancreatic cancer cells A:The relative expression of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 silencing detected by qRT-PCR;B:Cell viabilities of HPDE and BXPC3 cells determined by MTTassay;C:Thecolony formations BXPC3 and SW1990 cells measured by colony-forming assay

2.3 SOX21-AS1的靶miRNA預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

研究[17]表明，細(xì)胞質(zhì)lncRNA最常見的機(jī)制是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）來結(jié)合各種miRNA以抑制其對(duì)目標(biāo)mRNA的調(diào)節(jié)作用。為了確定SOX21-AS1是否可以作為miRNA的ceRNA，首先用qRT-PCR檢測(cè)了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中SOX21-AS1的表達(dá)，結(jié)果顯示，SOX21-AS1轉(zhuǎn)錄本大多存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖3A）。此外，通過DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到SOX21-AS1與miR-31-5p存在靶向結(jié)合序列（圖3B）。在BXPC3、SW1990細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后，miR-31-5p表達(dá)相比陰性對(duì)照組（miR-NC）明顯升高（均P＜0.01）（圖3C）。為了進(jìn)一步證實(shí)SOX21-AS1與miR-31-5p存在相互作用，將野生型（SOX21-AS1-WT）和突變型（SOX21-AS1-MT）結(jié)合miR-31-5p模擬物檢測(cè)熒光素酶活性，雙螢光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后，SOX21-AS1-WT在BXPC3細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低，而SOX21-AS1-MT的活性沒有明顯改變，同樣的，SOX21-AS1-WT在SW1990細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性也明顯減弱，而SOX21-AS1-MT的熒光素酶活性沒有明顯改變（P＜0.01）（圖3D），這不僅表明miR-31-5p是SOX21-AS1的直接靶標(biāo)，也能證明miR-31-5p與SOX21-AS1結(jié)合位點(diǎn)存在于突變載體附近。qRT-PCR結(jié)果表明，在BXPC3和SW1990細(xì)胞中，沉默SOX21-AS1會(huì)導(dǎo)致miR-31-5p表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.005）（圖3E）；與正常人胰腺組織相比，人胰腺癌組織中miR-31-5p的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）（圖3F）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-31-5p與SOX21-AS1的關(guān)系，將SOX21-AS1與miR-31-5p行相關(guān)性分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SOX21-AS1的表達(dá)與miR-31-5p呈負(fù)相關(guān)（r2=0.257 1，P＜0.05）（圖3G）。

圖3 SOX21-AS1與miR-31-5p的關(guān)系分析A：核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BXPC3與SW1990中SOX21-AS1的分布情況；B：DIANA預(yù)測(cè)SOX21-AS1與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列；C：qRT-PCR分析在BXPC3、SW1990細(xì)胞中過表達(dá)miR-31-5p后miR-31-5p的表達(dá)量；D：過表達(dá)miR-31-5p后，轉(zhuǎn)染SOX21-AS1-WT及SOX21-AS1-MT的BXPC3與SW1990細(xì)胞的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告；E：qRT-PCR檢測(cè)干擾SOX21-AS1后BXPC3、SW1990中miR-31-5p的表達(dá)；F：qRT-PCR檢測(cè)20例胰腺癌及鄰近正常組織中miR-31-5p的表達(dá)；G：SOX21-AS1與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 3 Analysis of the relationship between SOX21-AS1 and miR-31-5p A:The distributions of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells examined by nuclear cytoplasmic fractionation assay;B:The targeted binding sequence of SOX21-AS1 with miR-31-5Ppredicted by DIANA;C:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells after miR-31-5p overexpression;D:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells with miR-31-5p overexpression after transfection with SOX21-AS1-WT and SOX21-AS1-MT;E:Relative expression of miR-106a-3p in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 interference determined by qRT-PCR;F:Relative expression levels of miR-31-5p in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;G:Correlation analysis between SOX21-AS1 and miR-31-5p expression

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p的表達(dá)，進(jìn)行了部分挽救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-31-5p表達(dá)后，與對(duì)照組（si-NC）比較，挽救組（si-SOX21-AS1+miR-31-5p inhibitor）組胰腺癌BXPC3、SW1990細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)均明顯降低（均P＜0.01）（圖4A），提示該miR-31-5p抑制物有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沉默SOX21-AS1后，miR-31-5p的表達(dá)明顯上調(diào)，而在加入miR-31-5p抑制劑后，miR-31-5p的表達(dá)降低但仍明顯于高于si-NC組（P＜0.05）（圖4B）；同樣地，在沉默SOX21-AS1后，SOX21-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)，而在給予miR-31-5p抑制劑后，SOX21-AS1的表達(dá)明顯上調(diào)，但仍低于si-NC組（P＜0.01）（圖4C）。此外，在對(duì)BXPC3和SW1990進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與si-NC比較，si-SOX21-AS1#1組中細(xì)胞活力明顯下降，在加入miR-31-5p抑制劑后出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)（均P＜0.05）（圖4D）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在BXPC3、SW1990細(xì)胞中，與si-NC組比較，si-SOX21-AS1#1組中細(xì)胞增殖能力明顯減弱，在加入miR-31-5p抑制劑后，其增殖能力明顯恢復(fù)（均P＜0.01）（圖4E）。綜上提示，SOX21-AS1作為miR-31-5p的ceRNA在胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

圖4 SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p表達(dá)的驗(yàn)證A：qRT-PCR檢測(cè)使用miR-31-5p抑制劑后BXPC3、SW1990細(xì)胞中miR-31-5p的表達(dá)量；B：qRT-PCR檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞中，在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后miR-31-5p的表達(dá)量；C：qRT-PCR檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞系中，在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后SOX21-AS1的表達(dá)量；D：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑的BXPC3與SW1990細(xì)胞的細(xì)胞活力；E：細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在BXPC3、SW1990細(xì)胞中，加入si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和在此基礎(chǔ)上加入miR-31-5p抑制劑的細(xì)胞增殖能力Figure 4 Verification of targeted regulation of miR-31-5p expression by SOX21-AS1 A:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;B:Relative expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;C:Relative expression levels of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addition of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;D:Cell viabilities of BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by MTT assay;E:Proliferation abilities of BXPC3 and SW1990 cells after si-SOX21-AS1#1 transfection and miR-31-5p inhibitor addition detected by colony-forming assay

2.4 miR-31-5p的靶mRNA分析及驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確定SOX21-AS1影響胰腺癌病程的機(jī)制，在DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了miR-31-5p靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和MMP-16 mRNA包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。為了證實(shí)miR-31-5p與MMP-16之間存在相互作用，將MMP-16-WT與MMP-16-MT（與miR-31-5p模擬物的結(jié)合位點(diǎn)突變序列）克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31-5p模擬物明顯降低了BXPC3和SW1990中MMP-16-WT的細(xì)胞的螢光素酶活性（均P＜0.05），但在MMP-16-MT熒光素酶活性未見明顯變化（均P＞0.05）（圖5B）。此外，在胰腺癌腫瘤組織中MMP-16的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常胰腺上皮細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.01）（圖5C），同時(shí)，在進(jìn)行miR-31-5p與MMP-16相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)miR-31-5p的表達(dá)與MMP-16呈負(fù)相關(guān)（r2=0.311 3，P=0.010 6）（圖5D）。以上結(jié)果表明，miR-31-5p可能通過調(diào)節(jié)MMP-16參與胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展。

圖5 miR-31-5p靶向調(diào)節(jié)MMP-16 A：DIANA預(yù)測(cè)MMP-16與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列；B：加入miR-31-5p模擬物后，轉(zhuǎn)染MMP-16-WT與MMP-16-MT的BXPC3細(xì)胞與SW1990細(xì)胞的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)；C：qRT-PCR檢測(cè)20例胰腺癌及鄰近正常組織中MMP-16的表達(dá)量；D：MMP-16與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 5 Target regulation of MMP-16 expression by miR-31-5p A:The targeted binding sequence in miR-31-5Pwith MMP-16 predicted by DIANA;B:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells transfected with MMP-16-WT or MMP-16-MT after addition of miR-31-5p mimics;C:Relative expression levels of MMP-16 in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;D:Correlation analysis between MMP-16 and miR-31-5p expressions

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織和細(xì)胞系中SOX21-AS1水平升高，SOX21-AS1的下調(diào)抑制了胰腺癌細(xì)胞的活力和增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和miR-31-5p表達(dá)之間存在相互抑制，這說明SOX21-AS1在胰腺癌細(xì)胞中存在通過miR-31-5p介導(dǎo)的促癌作用。本研究還證明了SOX21-AS1可通過抑制miR-31-5p來正向調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中MMP-16的表達(dá)。

越來越多的證據(jù)表明，SOX21-AS1在多種類型的腫瘤中均起著腫瘤啟動(dòng)子的作用。例如，在結(jié)直腸癌患者中觀察到SOX21-AS1的顯著高表達(dá)，而過表達(dá)的SOX21-AS1通過影響miR-145/MY06促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展[18]。SOX21-AS1在肝細(xì)胞癌[19]，胃癌[20]，三陰性乳腺癌[21]和骨肉瘤[22]中也上調(diào)。與這些報(bào)道一致，本研究觀察到胰腺癌組織和細(xì)胞系中的SOX21-AS1水平分別高于正常組織和HPDE6細(xì)胞，這表明SOX21-AS1可能是胰腺癌中的促癌基因。

lncRNA可作為ceRNA發(fā)揮作用，從而消除了miRNA對(duì)它們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)源性抑制作用。通過核質(zhì)分離試驗(yàn)及qRT-PCR檢測(cè)，筆者猜測(cè)SOX21-AS1可能在胰腺癌中通過ceRNA方式起作用。為了解SOX21-AS1在胰腺癌中影響的潛在機(jī)制，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，SOX21-AS1中存在miR-31-5p的靶向序列，并已觀察到miR-31-5p在致癌作用中起抑癌基因的作用。先前的研究[23]表明，miR-31-5p通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），從而作為腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制因子。在膀胱癌[24]，鼻咽癌[25]，胃癌[26]和肝細(xì)胞癌中[27]，miR-31-5p表達(dá)也降低。同樣，本研究也確定在胰腺癌組織和細(xì)胞系中miR-31-5p減少。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1的下調(diào)顯著提高了miR-31-5p的水平，而在用miR-31-5p模擬物轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞中，SOX21-AS1的水平卻降低了；SOX21-AS1和miR-31-5p之間的互補(bǔ)對(duì)結(jié)合，并且進(jìn)一步證明SOX21-AS1與胰腺癌組織中的miR-31-5p呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，SOX21-AS1和miR-31-5p可能會(huì)形成相互抑制的反饋回路。

本研究探討了miR-31-5p是否會(huì)影響SOX21-AS1在胰腺癌細(xì)胞中的作用，結(jié)果揭示miR-31-5p抑制劑可以挽救SOX21-AS1的下調(diào)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生存能力和侵襲的抑制作用。SOX21-AS1的下調(diào)通過調(diào)節(jié)miR-31-5p抑制了胰腺癌細(xì)胞的活力和侵襲力。但是，當(dāng)前的研究不能排除SOX21-AS1也可能影響胰腺癌中其他miRNA或相關(guān)基因的可能性，這需要進(jìn)一步的研究。同時(shí)，在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析中，預(yù)測(cè)SOX21-AS1和MMP-16包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點(diǎn)。Zhang等[28]報(bào)道，miR-155通過靶向SOCS1和MMP-16促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。因此推測(cè)SOX21-AS1可能起抑制miR-31-5p的作用，從而正向調(diào)節(jié)MMP-16的表達(dá)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，MMP-16能誘導(dǎo)肝癌[29]、胃癌[30]等多種惡性腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，而目前鮮有報(bào)道其在胰腺癌中的相關(guān)作用。本研究初步證明了SOX21-AS1能夠通過抑制miR-31-5p正向調(diào)節(jié)MMP-16表達(dá)，繼而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖活力，這給未來MMP-16在胰腺癌中的研究提供了新的思路。

總之，胰腺癌組織和細(xì)胞系中的SOX21-AS1水平顯著降低，SOX21-AS1表達(dá)的下調(diào)通過miR-31-5p水平的上調(diào)降低了細(xì)胞活力和侵襲。這些結(jié)果表明，SOX21-AS1是預(yù)測(cè)預(yù)后的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，并且有望成為胰腺癌治療中的重要靶標(biāo)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。