基因芯片初步探討乳腺癌轉(zhuǎn)移相關蛋白Nucleobindin- 2介導的信號通路

符青云 歐陽小明 郅 程 曾 亮

1 廣東省江門市五邑中醫(yī)院病理科(江門 529031)

2 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科(廣州 510260)

3 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心病理科(廣州 510623)

本研究前期結果發(fā)現(xiàn)核結合蛋白2(nucleobindin- 2，NUCB2)表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預后有關[1]。關于NUCB2介導的信號通路有一些報道，如在結腸癌及子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)NUCB2通過LKB1/AMPK/TORC1/ZEB1途徑增強癌細胞的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[2，11- 12]。NUCB2通過雷帕霉素靶向途徑抑制卵巢癌細胞的增殖[3]。在本研究中，通過基因芯片方法研究乳腺癌細胞中NUCB2介導的信號通路及相關信號分子，為進一步闡明NUCB2乳腺癌中促轉(zhuǎn)移的功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用乳腺癌細胞株MDA-MB- 231，培養(yǎng)基為90%高糖DMEM+10%胎牛血清。 生長條件為95%空氣和5%CO2，37 ℃。qPCR所使用的引物序列見表1。

表1 qPCR的逆轉(zhuǎn)錄引物

1.2 RNAi 慢病毒載體構建、包裝、感染細胞并檢測感染效率

目的基因及工具載體信息，載體酶切：配制 50 μL 酶切體系。對載體酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。目的基因片段的獲?。汉诵男蛄小⒉《据d體構建框架、合成單鏈引物、引物退火形成雙鏈 DNA。退火產(chǎn)物與載體進行連接。轉(zhuǎn)化。菌落 PCR 鑒定。測序。質(zhì)粒抽提。最終用于實驗的分組包括對照組(無病毒感染的細胞組)、NC組(陰性對照病毒感染的細胞組)、KD組(感染NUCB2基因shRNA病毒的細胞組)。

1.3 總RNA 抽提及實時定量PCR

總RNA 抽提(上海普飛公司Trizol 試劑盒)抽提，收集細胞(6 孔板 80%細胞密度)，2 000 r/min離心 5 min，去上清，細胞沉淀中加入 1 mL Trizol，充分混勻后室溫靜置 5 min，然后轉(zhuǎn)至新的 1.5 mL EP 管中；每管加入 200 μL 氯仿，用手上下顛倒 EP 管 15 s，室溫靜置 10 min。4 ℃、12 800 r/min，離心 15 min。吸取上層液體轉(zhuǎn)至新的 1.5 mL EP 管，加入等體積預冷的異丙醇，混勻后 4 ℃靜置 10 min。4 ℃、12 800 r/min 離心 12 min 后，棄上清。加入 1 mL 、75%乙醇(用 DEPC 水新鮮配制)，洗滌沉淀。4 ℃、11 800 r/min離心5 min，棄去大部分上清。 4 ℃、11 800 r/min 再次離心5 min，棄去上清，室溫干燥。待 RNA 沉淀基本透明時，加入 RNase-free 水，至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C 分光光度計分析測定所抽提 RNA 的濃度及質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(使用Promega M-MLV 試劑盒)。

Real-time PCR 檢測按下列比例配置反應體系(12 μL體系)：MicroRNA PCR引物來自廣州市銳博生物科技有限公司。試劑每管加入量SYBR premix ex taq 6.0 μL，上游引物(5 μmol) 0.5 μL，下游引物(5 μmol) 0.5 μL，模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 1.0 μL，RNase-Free H2O 4.0 μL。② RNA PCR試劑 每管加入量SYBR premix ex taq 6.0 μL，引物mix(5 μmol) 0.3 μL，模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 0.6 μL，RNase-Free H2O 5.1 μL。相對定量分析F=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；ΔΔCt反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達水平，引物序列見表1。

1.4 Affymetrix基因表達譜芯片篩選下游通路相關基因

RNA 質(zhì)檢使用 NanoDrop2000 與 Agilent 2100 檢測。3′IVT 反應：總 RNA 起始量范圍：50～500 ng。RNA 擴增程序: First-Strand cDNA Synthesis 42 ℃，2 hr → 4 ℃保持。Second-Strand cDNA Synthesis 16 ℃，1 hr → 65 ℃，10 min → 4 ℃保持。IVT 40 ℃，16 hr → 4 ℃保持。Fragmentation 94 ℃，35 min → 4 ℃保持。poly-A RNA 對照準備：將稀釋好的 poly-A RNA 與總 RNA 混合，poly-A RNA 作為整個操作流程的內(nèi)部對照。一鏈 cDNA 合成：配制一鏈合成反應液，加入 poly-A RNA/總 RNA mix。使用“First-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成 cDNA。二鏈 cDNA 合成：配制二鏈合成反應液，加入一鏈合成產(chǎn)物。使用“Second-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成雙鏈的 cDNA 模板。IVT 反應：配制 IVT(體外反轉(zhuǎn))反應液，加入二鏈合成產(chǎn)物。使用“IVT”程序孵育，反轉(zhuǎn)獲得帶生物素標簽的 aRNA。aRNA 純化：用 GeneChip 3′IVT Express Kit 內(nèi)的純化試劑純化 aRNA。純化的 aRNA 用 nanodrop 2000 測定濃度。 aRNA 片段化：配制 aRNA 片段化反應液，加入已純化的 aRNA。Hybridization 98 ℃，10 min→ 45 ℃，3 min→ 45 ℃保持。使用“Fragmentation”程序孵育，獲得片段化產(chǎn)物。雜交: 配制雜交反應液。使用“Hybridization”程序加熱雜交液。同時，向芯片注入 130 μL 預雜交液，45 ℃雜交爐預雜交 10 min。吸去芯片的預雜交液，注入 130 μL 雜交液。放于雜交爐中，45 ℃，60 r/min 雜交 16 min。雜交完成后取出芯片，用 GeneChip Fluidics Station 450 儀器進行自動洗染。洗染完成后進行掃描，獲得數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計。需要分析的2組通過F檢驗(方差同質(zhì)性檢驗)進行檢驗。當F檢驗值大于0.05時，采用等方差雙樣本檢驗得到t檢驗值。當F檢驗值小于0.05時，采用異方差雙樣本檢驗得到t檢驗值。t檢驗值<0.05，說明兩個實驗組之間差異有統(tǒng)計學意義，t檢驗值>0.05，說明2組之間差異沒有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qPCR檢測乳腺癌細胞中NUCB2的表達

qPCR結果顯示與NC組比較，KD組NUCB2基因敲減效率達到90.6%，見圖1和表2。

圖1 qPCR顯示siRNA敲除后 MDA-MB- 231細胞株中NUCB2的mRNA水平

表2 qPCR顯示siRNA敲除后 MDA-MB- 231細胞株中NUCB2mRNA水平

2.2 Path-Array 芯片研究NUCB2介導的差異表達基因

在本項目中，使用基于經(jīng)驗偏差分布的線性模型來計算顯著性差異水平P值，并使用Benjamini-Hochberg方法來校正顯著性差異水平(false discovery rate,FDR)。顯著差異表達基因的篩選標準為|Fold Change|>1.5和FDR<0.05。與NC組比較，KD組上調(diào)基因186個，下調(diào)基因356個，部分差異表達基因見表3、表4。

表3 阻斷nucb2后MDA-MB- 231細胞部分上調(diào)基因

續(xù)表

續(xù)表

表4 阻斷NUCB2表達后MDA-MB- 231細胞部分下調(diào)基因

2.3 用qPCR驗證部分差異表達基因的表達情況

在MDA-MB- 231細胞株中，qPCR檢測阻斷NUCB2后部分上調(diào)基因，即與NC組比較KD組上調(diào)基因，包括即刻早期反應3相互作用蛋白1(immediate early response 3 interacting protein 1，IER3IP1)、基本轉(zhuǎn)錄因子3樣4(basic transcription factor 3-like 4， BTF3L4)、Rho-GDP解離抑制因子β(Rho GDP dissociation inhibitor beta，ARHGDIB)、胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin like growth factor binding protein 1，IGFBP1)，共濟失調(diào)蛋白1(ataxin, ATXN1)。結果顯示KD組IER3IP1、BTF3L4、ARHGDIB、IGFBP1、ATXN1的mRNA水平高于NC組，見圖2A-E。

在MDA-MB- 231中，qPCR檢測阻斷NUCB2后下調(diào)基因，即與NC組比較KD組下調(diào)基因，包括腸細胞激酶(intestinal cell kinase，ICK)、鉀通道四聚體化結構域12(potassium channel tetramerization domain containing 12, KCTD12)、熱休克蛋白家族D成員1(heat shock protein family D member 1, HSPD1)、PDX1 C末端抑制因子1(PDX1 C-terminal inhibiting factor 1，PCIF1)、細胞周期蛋白E2(cyclin E2, CCNE2)。結果顯示KD組的ICK、KCTD12、HSPD1、PCIF1、CCNE2的mRNA水平低于NC組，見圖2F-J。

圖3 qPCR對kd和nc部分差異表達基因的表達水平

2.4 NUCB2介導的差異表達基因的生物信息學分析

2.4.1 基于獨創(chuàng)性通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA)的經(jīng)典通路分析 圖4顯示差異基因在經(jīng)典通路中的顯著性富集情況。在圖4中，橫坐標為通路名稱，縱坐標為富集的顯著性水平(以10為底的負對數(shù)變換)；其中，橙色標注表示通路被激活(Z-score>0)，藍色標注表示通路被抑制(Z-score<0)，橙色和藍色的深淺(或Z-score的絕對值)代表激活或抑制的程度(依照IPA的內(nèi)部算法和標準，認為Z-score>2代表該通路被顯著激活，Z-score<- 2代表該通路被顯著抑制)；Ratio表示在此信號通路中差異基因數(shù)與該通路中包含的所有基因數(shù)的比值。在本項目中，膽固醇生物合成的超途徑(Superpathway of Cholesterol Biosynthesis)被顯著抑制，Z-score為- 3.162。

圖4 通過PathArray進行的NUCB2介導的經(jīng)典路徑分析

2.4.2 基于IPA的上游控制分析 上游調(diào)控因子分析表展示了本項目中所有差異基因的上游調(diào)控因子。上游調(diào)控因子可以是任何能夠影響基因表達的分子，它覆蓋了全部的分子類型，包括轉(zhuǎn)錄因子，細胞活素，小RNA，受體，激酶，化學分子和藥物。IPA使用了Activation Z-score算法，對上游調(diào)控子的激活或者抑制進行預測，并降低了由于隨機數(shù)據(jù)造成的顯著預測。在本項目中NUPR1被預測為強烈激活，該基因存在45個一致激活的基因，E2F1被預測為強烈抑制，該基因存在21個一致抑制的基因。

圖5 NUCB2上游調(diào)控因子網(wǎng)絡圖

2.4.3 基于IPA的疾病和功能分析 圖6顯示差異基因在疾病與功能中的顯著性富集情況。在圖6中，橫坐標為通路名稱，縱坐標為富集的顯著性水平(以10為底的負對數(shù)變換)。柱狀圖顯示出明顯的激活相關功能，包括金屬釋放、脂質(zhì)積聚和明顯的抑制相關功能如細胞死亡、肌肉萎縮。

圖6 NUCB2介導的疾病功能分析柱狀圖

圖7顯示差異基因表達水平的變化對疾病與功能的激活抑制關系。橙色代表疾病或功能狀態(tài)被激活(Z-score>0)，藍色代表疾病或功能狀態(tài)被抑制(Z-score<0)，灰色表示疾病或功能狀態(tài)未確定(Z-score無法計算)。依照IPA的內(nèi)部算法和標準，認為Z-score>2代表該疾病或功能被顯著激活，Z-score<- 2代表該疾病或功能被顯著抑制。顯著激活的疾病或功能包括：發(fā)病率或死亡率(Z-score=4.080)，生物的死亡(3.921)等；顯著抑制的疾病或功能包括：成纖維細胞株凋亡(- 2.481)，葡萄糖代謝障礙(- 2.380)等。

圖7 NucB2介導的疾病和功能的熱圖

圖8顯示基因與疾病或功能之間的激活與抑制關系。網(wǎng)絡中包含與指定的疾病或功能相關的所有差異基因，并展示了它們之間基于Ingenuity知識庫的可能的互作關系和表達變化趨勢。其中橙色線表示基因表達水平變化對該功能具有激活作用，藍色線表示基因表達水平變化對該功能具有抑制作用，黃色線表示基因表達水平變化對該功能的影響與現(xiàn)有文獻報道不一致，灰色線表示調(diào)控關系未知。

圖8 基因疾病或功能網(wǎng)絡圖

2.4.4 基于IPA的調(diào)控效應分析 圖9顯示差異基因參與的上游調(diào)控網(wǎng)絡與下游功能的可能的作用途徑。Consistency Score是網(wǎng)絡中上游調(diào)控因子、數(shù)據(jù)集和疾病與功能之間的因果關系一致性和密集連接的度量標準，Consistency Score越高，表示調(diào)控效應結果越準確。在本項目中DLL4等調(diào)控子通過CCNE2等基因?qū)enign lesion具有激活作用。

圖9 調(diào)控效應分析表

圖10展示了數(shù)據(jù)集中的基因與調(diào)控子和功能之間的相互作用關系。此調(diào)控效應分析中排名第一的調(diào)控網(wǎng)絡展示了數(shù)據(jù)集可能由于調(diào)控子DLL4, HDL-cholesterol, mir- 8通過CCNE2, DHCR7, EGR1, ETS1, FDFT1, FHOD1, GATA3, MCM3, MCM7, MYH10, NR2F2, SKP2, TGFB2等基因?qū)α夹圆∽?benign lesion)，先心病(congenital heart disease)，生長阻滯(growth failure)，圍產(chǎn)期死亡(perinatal death)具有激活作用，對細胞運動(cell movement), 體質(zhì)量(size of body)具有抑制作用。

圖10 調(diào)控效應網(wǎng)絡圖

3 討 論

本研究在以往對乳腺癌中NUCB2作用的蛋白質(zhì)組學和臨床病理學研究基礎上，進一步利用Path-Array芯片篩選了NUCB2介導的下游和信號通路。乳腺癌細胞中阻斷NUCB2后，發(fā)現(xiàn)共有186個上調(diào)基因和356個下調(diào)基因，其中一些差異表達基因經(jīng)過mRNA檢測進行驗證，驗證結果和Path-Array結果的高度一致。

應用IPA分析不同表達基因。首先，經(jīng)典的通路分析表明，阻斷NUCB2可抑制一系列通路包括膽固醇生物合成超級通路、膽固醇生物合成通路I、膽固醇生物合成通路II、膽固醇生物合成通路III、ERK/MAPK信號，其中膽固醇生物合成超級通路受到最顯著的抑制。據(jù)報道 Nesfatin- 1通過其受體誘導cAMP反應元件結合蛋白CREB的磷酸化，從而激活神經(jīng)元細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應的[4]。NUCB2調(diào)控EGF刺激的MAPK激酶/ERK信號傳導、細胞增殖和脂肪細胞分化，NUCB2敲除細胞的細胞增殖顯著降低[5]。

但是，NUCB2與膽固醇生物合成關系的研究還沒有直接報道。其次，上游調(diào)控因子分析表明，上游調(diào)控因子可以是影響基因表達的任何分子，它涵蓋了所有的分子類型，包括轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、小RNA、受體、激酶、化學分子和藥物。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控NUCB2的分子中，NUPR1被預測為強烈激活，E2F1被預測為強烈抑制，該基因有21個一致的基因。進一步的上游調(diào)控子網(wǎng)絡圖顯示了與上游調(diào)控因子直接相關的數(shù)據(jù)集中上游調(diào)控因子與下游分子共存的相互作用。例如，NUPR1可以提高Ets1的mRNA水平，但在實驗數(shù)據(jù)中Ets1明顯下調(diào)。NUPR1和IPP的表達趨勢一致。此外，IPA的疾病和功能柱狀圖顯示出明顯的激活相關功能，包括金屬釋放、脂質(zhì)積聚和明顯的抑制相關功能如細胞死亡、肌肉萎縮。

這些生物信息學分析結果表明，一方面是參與脂質(zhì)合成和代謝的途徑和分子可能在NUCB2功能中發(fā)揮重要作用，值得進一步研究。另一方面是釋放與NUCB2功能相關的金屬，NUCB2與G蛋白偶聯(lián)受體相互作用，導致鈣離子增加，這與培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元中蛋白激酶C的激活有關[6]。NUCB2通過N型通道刺激鈣離子內(nèi)流激活迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元，證實NUCB2可將信號傳到腦組織[7]。NUCB2也參與高爾基體內(nèi)鈣離子儲存，以及涉及DNA結合和蛋白質(zhì)相互作用的生物學過程。在沒有鈣離子的情況下，NUCB的鈣離子結合域處于無結構狀態(tài)，而加上Ca2+則會折疊[8,4]。據(jù)報道，NUCB2可抑制核因子kappa-B依賴性炎癥反應，減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后caspase- 3介導的神經(jīng)元細胞凋亡[9]。NUCB2通過參與Bax、Bcl-Xl和Bcl- 2基因以及ERK1/2, p38 和JNK1/2 信號級聯(lián)，抑制人腎上腺皮質(zhì)細胞模型(H295R)細胞的生長并促進凋亡。這提示NUCB2在腎上腺皮質(zhì)區(qū)發(fā)育中發(fā)揮作用，也可能是腎上腺癌的治療靶點[10，12]。據(jù)報道，NUCB2通過mTOR和RhoA/ROCK信號通路誘導凋亡，抑制人卵巢上皮癌HO- 8910細胞系的增殖[3]。NUCB2調(diào)控EGF刺激的MAPK激酶/ERK信號傳導、細胞增殖和脂肪細胞分化[5]。

關于NUCB2在疾病特別是腫瘤發(fā)生和進展中信號通路的研究報道較少，對于本研究發(fā)現(xiàn)的一些NUCB2相關信號通路，進一步的研究重點是闡明NUCB2功能與信號轉(zhuǎn)導途徑的關系。