水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)的工藝優(yōu)化及提取方法對其品質(zhì)的影響

潘 南，江婷婷，陳曉婷，徐清云，吳靖娜，蔡水淋,6，廖登遠(yuǎn)，劉智禹

(1.福建省水產(chǎn)研究所 國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013； 2.閩南師范大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；3.廈門軟件職業(yè)技術(shù)學(xué)院 軟件工程系，福建 廈門 361024； 4.廈門醫(yī)學(xué)院 廈門市海洋藥用天然產(chǎn)物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361023； 5.廈門醫(yī)學(xué)院 海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023； 6.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021)

紫海膽(Heliocidaricrassispina)隸屬于棘皮動(dòng)物門、海膽綱、拱齒目、長海膽科，廣泛分布于中國東海、南海海域以及日本沿海。紫海膽性腺，又稱紫海膽黃，是一種深受美食饕客追捧的健康食材，其脂質(zhì)占總質(zhì)量的10%～30%(干基)，包含甘油酯、磷脂、糖脂及脂溶性微量生物活性物質(zhì)等，賦予了其鮮醇甜潤的口感，并有益于維持機(jī)體健康穩(wěn)態(tài)。目前，紫海膽相關(guān)研究主要集中于營養(yǎng)成分分析、化學(xué)成分分離及結(jié)構(gòu)鑒定、增養(yǎng)殖及其對生態(tài)的影響等方面[1-3]，而關(guān)于其性腺脂質(zhì)的提取、理化性質(zhì)、脂質(zhì)組成、脂肪酸組成、營養(yǎng)指標(biāo)及熔融、結(jié)晶特性等研究鮮見報(bào)道。

傳統(tǒng)制油工藝具有高效、出油多等優(yōu)點(diǎn)，但存在能耗大、污染環(huán)境、操作危險(xiǎn)、殘?jiān)鞍鬃冃試?yán)重、毛油成分復(fù)雜、有機(jī)溶劑殘留等問題[4]。水酶法是一種條件溫和、綠色安全、副產(chǎn)物價(jià)值高的制油工藝，目前已應(yīng)用于橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油、椰子油等的工業(yè)化生產(chǎn)，創(chuàng)造了良好的社會與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。近年來，水酶法被越來越多地應(yīng)用于微藻和類微藻原生生物、海洋浮游動(dòng)物、水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物等海洋膳食脂質(zhì)的制備[6-8]。然而，油料的巨大差異對提取工藝的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提出了更多適應(yīng)性要求，因此亟需針對特定油料性質(zhì)、工藝技術(shù)以及脂質(zhì)品質(zhì)之間的相互關(guān)系開展研究，以推動(dòng)水酶法技術(shù)在海洋膳食脂質(zhì)領(lǐng)域的不斷完善。

本研究以福建省泉州市永寧鎮(zhèn)近海海域采集的紫海膽性腺為對象，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化水酶法提取脂質(zhì)工藝，并基于GC-MS、Generik Diol SPE、HPTLC和DSC等技術(shù)，以脂質(zhì)的得率、理化性質(zhì)、脂肪酸組成、營養(yǎng)指標(biāo)、脂質(zhì)組成、熔融與結(jié)晶特性為指標(biāo)，探討了水酶法、Folch法和Matyash法對紫海膽性腺脂質(zhì)品質(zhì)的影響，以期為水酶法制備高品質(zhì)海洋膳食脂質(zhì)產(chǎn)品及其應(yīng)用提供更多的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

紫海膽，采集于福建省泉州市永寧鎮(zhèn)近海海域，保活運(yùn)輸至福建省水產(chǎn)研究所，開殼，取出性腺，使用1%食鹽水漂洗后，瀝干水分，真空冷凍干燥，粉碎、過0.425 mm(40目)篩，真空袋密封，-20℃保藏。

中性蛋白酶(5萬U/g)、堿性蛋白酶(5萬U/g)、風(fēng)味蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(20萬U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；正己烷、異辛烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、冰乙酸、碘化鉀、鹽酸、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，分析純；韋氏試劑；硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液；氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)、甘油一酯與甘油二酯和甘油三酯混標(biāo)、單半乳糖甘油二酯(MGDG)、磷脂酰甘油(14∶0 PG)、磷脂酰膽堿(21∶0 PC)、磷脂酰乙醇胺(18∶0 PE)、磷脂酰肌醇(18∶0 PI)、磷脂酰絲氨酸(16∶0 PS)、櫻草黃，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890N/5975B氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(GC-MS)，美國安捷倫科技有限公司；SP?-2560毛細(xì)管GC色譜柱(100 m×0.25 mm，0.20 μm)、VisiprepTMSPE真空固相萃取裝置、60 F254高效硅膠薄層色譜板，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；氣體鋼瓶，廈門藝東氣體有限公司；Generik Diol SPE小柱，蘇州賽分科技有限公司；DSC 3差示掃描量熱儀、FE28-Standard pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多國際有限公司；5804R臺式離心機(jī)，德國艾本德(中國)有限公司；916Ti-Touch全自動(dòng)電位滴定儀，瑞士萬通中國有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；NV-15G氮吹儀，天津博納艾杰爾科技有限公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Recirculating Chiller F-305循環(huán)冷卻器、Vacuum Pump V-100真空泵，步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器；雙槽展開缸；ZF-90B多功能紫外透射儀；DHG-9141A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；MX-RL-Pro旋轉(zhuǎn)混勻儀，美國賽洛捷克有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)

精確稱取2 g紫海膽性腺粉末，加入酶制劑和相應(yīng)緩沖溶液，在一定溫度下酶解一定時(shí)間。酶解完成后，沸水浴滅酶10 min，加入25%氯化鈉、65%無水乙醇[9]，超聲15 min，調(diào)節(jié)pH至4.5，離心，加入適量正己烷萃取油相3次，合并萃取液，35℃氮?dú)獯蹈芍梁阒?，?jì)算脂質(zhì)得率(脂質(zhì)得率=紫海膽性腺脂質(zhì)質(zhì)量/紫海膽性腺質(zhì)量×100%)。實(shí)驗(yàn)所用4種酶制劑的最適溫度、最適pH和相應(yīng)的緩沖溶液見表1。

表1 蛋白酶最適酶解條件

1.2.2 Folch法提取紫海膽性腺脂質(zhì)[10]

精確稱取1 g紫海膽性腺粉末，按料液比1∶20加入氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)萃取1 h，離心后移取上層萃取液，沉淀重復(fù)萃取2次，合并萃取液，加入1/4體積的0.9%氯化鈉溶液，離心后收集氯仿層，35℃氮?dú)獯蹈芍梁阒?，?jì)算脂質(zhì)得率。

1.2.3 Matyash法提取紫海膽性腺脂質(zhì)[11]

精確稱取1 g紫海膽性腺粉末，按料液比1∶20加入甲基叔丁基醚-甲醇(體積比1.5∶5.0)溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)萃取1 h，加入1/5體積去離子水，離心后收集甲基叔丁基醚層，35℃氮?dú)獯蹈芍梁阒?，?jì)算脂質(zhì)得率。

1.2.4 紫海膽性腺脂質(zhì)理化性質(zhì)的測定

色澤、氣味測定參考GB/T 5492—2008；酸值測定參考GB 5009.229—2016；碘值測定參考GB/T 5532—2008；過氧化值測定參照GB 5009.227—2016；皂化值測定參考GB/T 5534—2008。

1.2.5 紫海膽性腺脂質(zhì)脂肪酸組成分析

甲酯化：稱取適量紫海膽性腺脂質(zhì)，加入20 μL 0.5 μg/μL內(nèi)標(biāo)(21∶0 PC)和2 mL甲醇-濃硫酸溶液(體積比25∶1)，渦旋混勻，80℃水浴1 h，待冷卻后加入2 mL正己烷和1 mL水，渦旋振蕩，離心，取上層有機(jī)相至新玻璃管，加1 mL水，渦旋振蕩，離心；再取上層有機(jī)相至另一新玻璃管，氮?dú)獯蹈?；加?00 μL異辛烷，渦旋振蕩，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，供GC-MS檢測分析。

GC條件：進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度均為280℃；載氣為高純氦氣；氫氣流量30 mL/min；空氣流量300 mL/min；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持1 min，以10℃/min升溫至170℃，保持5 min，以5℃/min升溫至175℃，以1℃/min升溫至210℃，保持5 min，以5℃/min升溫至240℃，保持20 min。

MS條件：電離方式EI，離子源溫度200℃，接口溫度300℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z)20～500。

1.2.6 紫海膽性腺脂質(zhì)營養(yǎng)指標(biāo)分析

紫海膽性腺脂質(zhì)致動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)(AI)[12]、血栓形成指標(biāo)(TI)[12]、促進(jìn)健康指標(biāo)(HPI)[13]、不飽和指標(biāo)(UI)[14]分別按公式(1)～(4)計(jì)算，以評價(jià)不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)對人類心血管疾病的潛在影響。

IA=(C12∶0+4C14∶0+C16∶0)/(∑MUFA+∑n-3 PUFA+∑n-6 PUFA)

(1)

IT=(C14∶0+C16∶0+C18∶0)/(0.5∑MUFA+3∑n-3 PUFA+0.5∑n-6 PUFA+∑n-3 PUFA/∑n-6 PUFA)

(2)

IHP=(∑MUFA+∑PUFA)/(C12∶0+4C14∶0+C16∶0)

(3)

IU=C1+2C2+3C3+4C4+5C5+6C6

(4)

式中：IA為致動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)；IT為血栓形成指標(biāo)；IHP為促進(jìn)健康指標(biāo)；IU為不飽和指標(biāo)；MUFA為單不飽和脂肪酸;n-3 PUFA為n-3型多不飽和脂肪酸;n-6 PUFA為n-6型多不飽和脂肪酸;C1為單烯酸含量;C2為二烯酸含量;C3為三烯酸含量;C4為四烯酸含量;C5為五烯酸含量;C6為六烯酸含量。

1.2.7 紫海膽性腺脂質(zhì)組成分析

采用Generik Diol SPE小柱對不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)進(jìn)行分離、純化。使用6 mL甲醇、6 mL丙酮和6 mL正己烷對SPE小柱進(jìn)行除雜和活化，取適量脂質(zhì)溶于二氯甲烷溶液中，上樣。使用6 mL正己烷洗脫中性脂、6 mL丙酮洗脫糖脂、6 mL甲醇洗脫磷脂，洗脫液35℃氮?dú)獯蹈芍梁阒亍Ｒ韵疵撝|(zhì)質(zhì)量占上樣紫海膽性腺脂質(zhì)質(zhì)量的比例表示脂質(zhì)分布情況。

采用高效薄層色譜法鑒定不同脂質(zhì)。使用HPTLC Silica gel 60 F254型硅膠板，中性脂以正己烷-乙醚-冰乙酸(體積比80∶20∶2)為展開劑，糖脂和磷脂均以乙酸乙酯-異丙醇-二氯甲烷-甲醇-0.25% KCl(體積比25∶25∶25∶10∶9)為展開劑，室溫展開[15]。以櫻草黃(0.01%溶于80%丙酮)為顯色劑，365 nm紫外燈下檢視、拍照。

1.2.8 紫海膽性腺脂質(zhì)熱力學(xué)分析

采用差示掃描量熱儀分析紫海膽性腺脂質(zhì)的熔融與結(jié)晶特性。稱取適量紫海膽性腺脂質(zhì)于鋁盤中并密封，空盤密封作為對照，50 mL/min氮?dú)獗Ｗo(hù)下測試：25℃保持1 min，50℃/min升溫至80℃，保持10 min；10℃/min降溫至-55℃，保持10 min；5℃/min 重新升溫至80℃。記錄冷卻和重新加熱過程中脂質(zhì)結(jié)晶與熔融情況。使用STARe Evaluation Software Version 16.20軟件分析示溫圖。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)工藝優(yōu)化

2.1.1 酶制劑的選擇

酶制劑對油料及其催化反應(yīng)具有嚴(yán)格的選擇性。不同酶制劑對同一油料中脂蛋白、脂多糖等復(fù)合體酶解，由于酶切位點(diǎn)不同，脂質(zhì)從油料中釋放能力不同。與此同時(shí)，酶制劑能破壞油滴表面脂膜，降低乳化液的穩(wěn)定性，從而提高脂質(zhì)得率。在料液比1∶20，酶解時(shí)間3 h，酶添加量3 000 U/g，各酶最適溫度、最適pH、相應(yīng)緩沖溶液條件下，研究不同酶制劑對水酶法提取脂質(zhì)得率的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同酶制劑提取紫海膽性腺脂質(zhì)得率 %

由表2可知，中性蛋白酶脂質(zhì)得率最高，其次為堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶的最低。因此，選取中性蛋白酶作為最適酶制劑。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 酶添加量的影響

采用中性蛋白酶，在pH 7、料液比1∶20、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h的條件下，研究酶添加量對水酶法提取脂質(zhì)得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶添加量對脂質(zhì)得率的影響

由圖1可知，在酶添加量1 000～9 000 U/g范圍內(nèi)，脂質(zhì)得率隨著酶添加量的增加而增加。酶添加量為1 000～3 000 U/g時(shí)的脂質(zhì)得率顯著低于9 000 U/g的脂質(zhì)得率，當(dāng)酶添加量達(dá)到7 000 U/g時(shí)，酶添加量對脂質(zhì)得率增效無顯著影響，酶添加量為9 000 U/g時(shí)，脂質(zhì)得率達(dá)到最大值。隨著酶添加量的增多，酶與油料結(jié)合程度提高，酶解效果越明顯；而隨著酶與油料結(jié)合位點(diǎn)的飽和，繼續(xù)添加酶制劑已無法增大酶促效應(yīng)，脂質(zhì)得率趨于穩(wěn)定。因此，選擇最佳酶添加量為7 000 U/g。

2.1.2.2 酶解時(shí)間的影響

采用中性蛋白酶，在pH 7、料液比1∶20、酶解溫度50℃、酶添加量3 000 U/g的條件下，研究酶解時(shí)間對水酶法提取脂質(zhì)得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對脂質(zhì)得率的影響

由圖2可知，在酶解時(shí)間1～5 h內(nèi)，脂質(zhì)得率隨著酶解時(shí)間的延長而顯著增大，當(dāng)酶解時(shí)間超過4 h，脂質(zhì)得率趨于穩(wěn)定，無顯著性變化。這是因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，油脂、游離肽、氨基酸等酶解產(chǎn)物被釋放至反應(yīng)體系中，反向作用于酶制劑，進(jìn)而抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行。因此，選擇酶解時(shí)間為4 h。

2.1.2.3 pH

采用中性蛋白酶，在料液比1∶20、酶解溫度50℃、酶添加量3 000 U/g、酶解時(shí)間3 h的條件下，研究pH對水酶法提取脂質(zhì)得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH對脂質(zhì)得率的影響

由圖3可知，pH在6～8內(nèi)，脂質(zhì)得率隨著pH增加先增加后降低，在pH為7時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)橹行缘鞍酌妇哂袃尚噪娊庑再|(zhì)，其活性中心功能基團(tuán)的解離狀態(tài)隨著反應(yīng)體系pH的改變而改變，直接影響酶活力及其與油料的結(jié)合能力，進(jìn)而影響脂質(zhì)得率。因此，選擇最佳pH為7。

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用中性蛋白酶，固定料液比1∶20、酶解溫度50℃，以脂質(zhì)得率為指標(biāo)，選取酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)與pH(C)為因素，根據(jù)L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表3，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，不同因素影響水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)得率的主次順序依次為pH(C)>酶添加量(A)>酶解時(shí)間(B)。水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)得率最優(yōu)組合為A3B3C2,即酶添加量7 500 U/g、酶解時(shí)間5 h、pH 7，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，紫海膽性腺脂質(zhì)得率平均值達(dá)到23.22%。

2.2 不同提取方法對紫海膽性腺脂質(zhì)得率和品質(zhì)的影響

2.2.1 對脂質(zhì)得率的影響

不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)得率的影響如圖4所示。

圖4 不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)得率的影響

從圖4可以看出，水酶法脂質(zhì)得率((23.22±0.29)%)顯著低于Folch法((27.27±0.40)%)和Matyash法((27.14±0.18)%)。分別以Folch法與Matyash法脂質(zhì)得率為總脂得率，水酶法脂質(zhì)提取率分別為(85.14±1.05)%和(85.54±1.05)%，與水酶法提取光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)性腺脂質(zhì)的提取率((82.0±2.1)%)[9]相比略高，這可能與油料性質(zhì)(海膽的種類、捕撈季節(jié)、貯藏條件)、破乳工藝、儀器設(shè)備與人為操作等因素的差異有關(guān)。宋玉昆等[16]比較了索氏法、水酶法和超臨界CO2法(SC-CO2)提取西伯利亞鱘魚(Acipenserbaerii)卵脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)水酶法脂質(zhì)得率顯著低于索氏法，但高于SC-CO2法；Zhou等[17]比較了索氏法、水酶法和SC-CO2提取扇貝(Patinopectenyessoensis)內(nèi)臟脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，水酶法脂質(zhì)得率顯著低于其余兩種方法。由此可見，不同工藝對脂質(zhì)得率具有顯著影響，水酶法具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、操作安全、綠色環(huán)保、副產(chǎn)物價(jià)值高等優(yōu)勢，但仍存在成本高、游離油得率低、破乳工藝復(fù)雜等技術(shù)瓶頸，有待進(jìn)一步提升與優(yōu)化。

2.2.2 對脂質(zhì)理化性質(zhì)的影響

不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)理化性質(zhì)的影響如表5所示。

表5 不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)理化性質(zhì)的影響

從表5可以看出，水酶法脂質(zhì)的澄清度較差、顏色較淺，呈橙黃色。3種工藝提取脂質(zhì)均有特殊的魚腥味，有待進(jìn)一步精煉脫臭。3種工藝提取脂質(zhì)的酸值、皂化值差異均不顯著。水酶法與Matyash法脂質(zhì)的碘值差異不顯著，但均顯著高于Folch法，反映了前兩種工藝提取脂質(zhì)的不飽和度高于Folch法，氧化穩(wěn)定性弱于Folch法。3種工藝提取脂質(zhì)的過氧化值均較低，其中水酶法提取脂質(zhì)的過氧化值(0.006 g/100 g)最低，說明該工藝提取過程中脂肪酸氧化降解形成的氫過氧化物較少、酸敗程度較低。由此可知，水酶法提取的脂質(zhì)具有較低的過氧化值、較高的碘值，品質(zhì)較好。

2.2.3 對脂肪酸組成與營養(yǎng)指標(biāo)的影響

不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)脂肪酸組成見表6。

由表6可以看出：3種工藝提取脂質(zhì)中均檢測出29種脂肪酸，其中SFA含量最高，以C14∶0、C16∶0、C24∶0為主；PUFA含量次之，以C20∶4n6和C20∶5n3(EPA)為主；MUFA含量最少，以C18∶1n7、C20∶1n9、C22∶1n9為主。Folch法的SFA含量顯著高于Matyash法和水酶法，水酶法的PUFA含量顯著高于Folch法，而MUFA組間比對沒有顯著差異，說明不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)SFA與PUFA含量具有顯著影響。水酶法與Matyash法的EPA與C22∶6n3(DHA)總含量均顯著高于Folch法，說明以上兩種方法提取的脂肪酸具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

表6 不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)的脂肪酸組成 %

具有較低AI、TI和較高HPI、UI的膳食脂質(zhì)更有利于心血管疾病的預(yù)防與治療。不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)的營養(yǎng)指標(biāo)如表7所示。

從表7可以看出：水酶法提取脂質(zhì)的AI顯著低于Folch法與Matyash法，TI顯著低于Folch法，HPI顯著高于Folch法與Matyash法，UI顯著高于Folch法，說明水酶法提取脂質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值更好。與其他膳食食物相比，水酶法紫海膽性腺脂質(zhì)的AI(1.46)顯著高于羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)[18](0.81)、養(yǎng)殖雞[19](0.372～0.390)、綿羊[20](0.49～0.52)；TI(0.51)顯著低于養(yǎng)殖雞[19](0.755～0.784)、綿羊[20](1.1～1.15)和小母牛[21](1.10～1.34)等養(yǎng)殖肉類，但高于羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)[18](0.29)；HPI(0.69)較牛奶、奶酪[13]更高，UI(1.59)顯著高于大豆[22](1.48～1.55)與豬肉[23](1.11～1.24)，表明其具有較好的不飽和程度及常溫流動(dòng)性，更有利于健康穩(wěn)態(tài)的維持。

表7 不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)的營養(yǎng)指標(biāo)

綜上，水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)的SFA含量較低，PUFA含量較高，EPA與DHA總含量最高，營養(yǎng)指標(biāo)均較好，具有更好的預(yù)防心血管疾病、促進(jìn)健康穩(wěn)態(tài)的功效。

2.2.4 對脂質(zhì)組成的影響

基于Generik Diol SPE技術(shù)對不同脂質(zhì)組分分離、純化的研究鮮有報(bào)道[24]。本研究采用Generik Diol SPE技術(shù)對不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)進(jìn)行分離、純化，采用高效薄層色譜法對各洗脫脂質(zhì)成分進(jìn)行定性分析，中性脂(A)、糖脂(B)和磷脂(C)的高效薄層色譜圖見圖5，不同工藝對紫海膽性腺脂質(zhì)組成的影響見圖6。

注：1.水酶法； 2.Folch法； 3.Matyash法。

由圖5可知，基于Generik Diol SPE法分離不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)中性脂(A)、糖脂(B)和磷脂(C)，在與標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的位置上，均顯示出白色斑點(diǎn)，說明Generik Diol SPE法具有較好的分離中性脂、糖脂和磷脂的作用。由圖6可知，不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)的中性脂含量差異不顯著，糖脂、磷脂含量存在一定差異，其中：水酶法的糖脂含量((17.40±0.31)%)與Folch法無顯著性差異，但顯著低于Maytash法的；水酶法的磷脂含量((4.23±0.36)%)則顯著低于其他兩種方法的。采用水酶法提取藻類脂質(zhì)同樣存在磷脂含量較低的現(xiàn)象[25]。水酶法使用了水相與正己烷體系，F(xiàn)olch法與Maytash法分別采用了氯仿-甲醇(體積比2∶1)與甲基叔丁基醚-甲醇(體積比1.5∶5.0)體系，不同溶劑極性大小排序?yàn)樗?甲醇>氯仿>甲基叔丁基醚>正己烷。根據(jù)相似相溶原理，水酶法提取的糖脂與磷脂易溶于極性體系中，破乳工藝進(jìn)一步促進(jìn)了磷脂的相分離過程，因此水酶法極性脂得率較低。綜上，水酶法對磷脂的選擇性較低，有待進(jìn)一步改良。

2.2.5 對脂質(zhì)熔融與結(jié)晶特性的影響

脂質(zhì)的熔融與結(jié)晶特性影響其品質(zhì)、穩(wěn)定性和適用性。不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)熔融過程和結(jié)晶過程DSC曲線見圖7。由于DSC熔融曲線低溫側(cè)帶凹陷，因此以峰值溫度(Tp)為表征，該熔融、結(jié)晶過程所吸收或釋放的熱量為熔融、結(jié)晶的熱焓(ΔH)[26]，上述轉(zhuǎn)變溫度見表8、熔融/結(jié)晶熱焓見表9。

由圖7(A)可知，水酶法與Matyash法脂質(zhì)在-30～40℃ 范圍內(nèi)一共出現(xiàn)4個(gè)吸熱峰，F(xiàn)olch法脂質(zhì)在-30～40℃范圍內(nèi)一共出現(xiàn)3個(gè)吸熱峰，其中峰3為Folch法脂質(zhì)熔融的主要區(qū)域，峰3、峰4為水酶法與Matyash法脂質(zhì)熔融的主要區(qū)域，3種工藝提取脂質(zhì)低溫范圍的吸熱峰均比高溫范圍的吸熱峰弱、峰寬均比高溫范圍的峰寬窄，說明上述脂質(zhì)均為同質(zhì)多晶型，所含甘油三酯種類較多，熔點(diǎn)溫度相對不集中。由表8、表9可知：水酶法與Matyash法脂質(zhì)峰3的Tp分別為(13.92±0.41)℃和(12.51±0.34)℃，ΔH分別為(-6.76±1.60)J/g和(-9.75±0.67)J/g，而Folch法脂質(zhì)在此溫度附近無明顯的相轉(zhuǎn)變，說明在該溫度范圍水酶法和Matyash脂質(zhì)與Folch法脂質(zhì)相比具有更多固態(tài)向液態(tài)的轉(zhuǎn)變，熔點(diǎn)顯著較低；水酶法與Matyash法脂質(zhì)峰4的Tp((28.59±0.26)℃與(29.76±0.34)℃)與Folch法脂質(zhì)峰3的Tp((29.51±0.89)℃)相比沒有顯著性差異，而水酶法峰4的ΔH絕對值顯著低于Folch法脂質(zhì)峰3與Matyash法脂質(zhì)峰4的ΔH絕對值，說明水酶法脂質(zhì)的主要熔融過程熱流變化較小、吸熱較少，與其含有較少的SFA、較多的PUFA變化規(guī)律一致。3種工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)的熔融溫度均低于人體生理溫度(36.6～37.3℃)，其與哺乳動(dòng)物乳脂[27]、藻油[28]相比，具有較好的乳化、吸收與代謝等特性，有利于進(jìn)一步開發(fā)海洋膳食營養(yǎng)脂質(zhì)產(chǎn)品。

由圖7(B)可知，水酶法、Folch法與Matyash法提取的紫海膽性腺脂質(zhì)均分別在0～20℃和-20～0℃范圍內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)放熱峰，且高溫范圍的放熱峰均比低溫范圍的放熱峰尖銳、峰寬均比低溫范圍的峰寬窄。由表8可知，水酶法與Matyash法脂質(zhì)的第一個(gè)放熱峰Tp((8.83±0.82)℃與(9.66±0.21)℃)均顯著低于Folch法((11.73±0.37)℃)，水酶法脂質(zhì)第二個(gè)放熱峰Tp((-10.56±0.19)℃)顯著低于Folch法((-7.70±0.63)℃)與Matyash法((-7.97±0.17)℃)，說明水酶法脂質(zhì)具有較低的結(jié)晶溫度，與其所含SFA、PUFA含量變化規(guī)律一致。由表9可知，從熱效應(yīng)的角度看，水酶法、Folch法與Matyash法提取脂質(zhì)的第一個(gè)放熱過程均顯著強(qiáng)于第二個(gè)放熱過程，熱效應(yīng)分別約為第二個(gè)放熱過程的1.4、1.3倍和1.2倍。脂質(zhì)加工過程，通常使用結(jié)晶過程改善品質(zhì)及穩(wěn)定性，因此可利用該結(jié)晶特性通過控制溫度對脂質(zhì)進(jìn)一步分離、純化，以保證脂質(zhì)在低溫長期貯藏的穩(wěn)定性。

圖7 不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)在熔融(A)與結(jié)晶(B)過程的DSC曲線

表8 不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)的DSC熔融/結(jié)晶曲線中轉(zhuǎn)變溫度的比較

表9 不同工藝提取紫海膽性腺脂質(zhì)的DSC曲線中熔融/結(jié)晶熱焓的比較

綜上，不同工藝提取的紫海膽性腺脂質(zhì)具有天然油脂同質(zhì)多晶的特性，水酶法提取的脂質(zhì)具有較低的熔融與結(jié)晶溫度，更好的乳化、吸收與代謝的特性，因此水酶法更適合高品質(zhì)海洋膳食脂質(zhì)產(chǎn)品的開發(fā)。

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)的工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件為料液比1∶20、中性蛋白酶添加量7 500 U/g、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間5 h和pH 7，該條件下脂質(zhì)得率為(23.22±0.29)%，顯著低于Folch法和Matyash法。與Folch法和Matyash法相比，水酶法提取紫海膽性腺脂質(zhì)的過氧化值較低，碘值較高，SFA含量((51.48±2.16)%)較低，PUFA含量((34.53±0.87)%)較高，EPA與DHA總含量((15.04±0.30)%)較高；營養(yǎng)指標(biāo)均較好；磷脂得率((4.23±0.36)%)較低；熔融溫度與結(jié)晶溫度較低。由此可見，水酶法工藝所提取的紫海膽性腺脂質(zhì)品質(zhì)佳，具有較好的營養(yǎng)價(jià)值、較好的預(yù)防心血管疾病的功效，較低的熔融與結(jié)晶溫度。因此，水酶法更適合高品質(zhì)紫海膽性腺脂質(zhì)的研制。