清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響?

張玉香，王一強，姜德民，史曉偉，杜發(fā)強

1 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730300；2 甘肅省中醫(yī)院；3 甘肅醫(yī)學(xué)院

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生呈現(xiàn)逐年上升趨勢。腸道菌群具有代謝、營養(yǎng)、免疫、屏障保護功能［1］。腸道內(nèi)環(huán)境平衡保證了機體健康。動物實驗［2］表明，清肝祛濕活血方具有活血化瘀，清肝祛濕等作用。本研究通過大鼠腸道中所含大腸桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌等菌落數(shù)變化，觀察清肝祛濕活血方對大鼠腸道菌群的影響，闡明該方治療NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物選取體質(zhì)量（150±20）g 的同批次雄性清潔級SD大鼠90只（購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心），實驗動物許可證號：SYXK（甘）2011-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物清肝祛濕活血方中藥煎劑（夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g）由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實驗室制備；血脂康（北京北大維信生物科技有限公司，國藥準(zhǔn)字號Z10950029，規(guī)格：0.3 g×36粒）。

1.3 試劑BC瓊脂、莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基、大腸菌群培養(yǎng)基（日本）、腸球菌瓊脂均購自青島海博生物公司。

1.4 儀器IX71-22FL/PH 型奧林巴斯倒置熒光顯微鏡（上海宣浦化工有限公司）；HH-8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市凱航儀器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；BBSDDC 型單人潔凈工作臺（博科公司）；LDZF-75KB 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；TG-18W型高速離心機（博科公司）；TC-120 型智能程控生物組織自動脫水機（湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組 選取SD 大鼠90 只，隨機分為空白組、模型組、血脂康組及清肝祛濕活血方低、中、高劑量組各15只。

1.5.2 造模 常規(guī)飼養(yǎng)7 天后，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)60 天；其余各組采取聶文山等［3］的造模方法造模，予高脂飼料（84%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇）喂養(yǎng)30天，并于造模后腹腔注射四環(huán)素150 mg/kg后每6天腹腔注射1次四環(huán)素100 mg/kg，共5 次，并于實驗前（0 天）和制模后6、12、18、24、30 天測量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，第30 天造模成功（預(yù)試驗造模，共計12 只大鼠，每組2 只，造模后每組選取1 只進行肝組織病理切片，染色后有明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，局灶性肝細(xì)胞壞死，淋巴細(xì)胞浸潤，證明預(yù)試驗造模成功）。在有氧、無菌條件下通過按摩刺激大鼠腹部使其盡快排便，將糞便盛于嚴(yán)格滅菌的EP管內(nèi)，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 給藥 造模結(jié)束后，即第31 天開始，參照《藥理實驗方法學(xué)》，大鼠用藥量應(yīng)為成人用藥量的9 倍［3］。換算出大鼠對應(yīng)中劑量給藥量應(yīng)為11.25 g生藥/kg。清肝祛濕活血方高、中、低劑量組分別給予22.5 g、11.25 g、5.63 g生藥/kg，血脂康組給血脂康混懸液0.1 g/kg。各組連續(xù)給藥30天，空白組與模型組每日灌胃等體積蒸餾水1次。

1.5.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測 第61 天開始，即最后1 次給藥24 h 后，無菌條件下消毒大鼠腹部，取盲腸和直腸中的糞便，同時取出?20℃保存的糞便4℃解凍，解凍時間不能超過18 h。在超凈套上取各組大鼠糞便，置于滅菌硫酸紙上稱重，然后放入帶玻璃珠的干燥滅菌小試管中，按文獻［4］方法稀釋后分別接種于各自對應(yīng)的培養(yǎng)基上，計數(shù)各培養(yǎng)基菌落數(shù)目，并對雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、大腸桿菌進行菌群分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 分析數(shù)據(jù)，以±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析和t檢驗；組間比較采用多組間方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌與乳酸桿菌菌落數(shù)與空白組比較，給藥前各組雙歧桿菌與乳酸桿菌數(shù)量降低（P＜0.05）。與模型組比較，給藥后血脂康組及清肝祛濕活血方低、中、高劑量組雙歧桿菌與乳酸桿菌數(shù)量增加（P＜0.05）。見表1—2。

表1 各組大鼠糞便中雙歧桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

表1 各組大鼠糞便中雙歧桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組血脂康組清肝祛濕活血方低劑量組清肝祛濕活血方中劑量組清肝祛濕活血方高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15劑量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50給藥前9.24±0.47 8.95±0.44*8.92±0.43*8.94±0.82*8.90±0.62*8.92±0.59*給藥后9.20±0.40 8.99±0.29*9.32±0.56#9.28±0.35#9.39±0.36#9.45±0.48#

2.2 腸球菌與大腸桿菌菌落數(shù)與空白組比較，給藥前各組腸球菌與大腸桿菌數(shù)量增加（P＜0.05）；給藥后，與模型組比較，血脂康組及清肝祛濕活血方低、中、高劑量組腸球菌與大腸桿菌菌落數(shù)減少（P＜0.05）。見表3—4。

表2 各組大鼠糞便中乳酸桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

表2 各組大鼠糞便中乳酸桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組血脂康組清肝祛濕活血方低劑量組清肝祛濕活血方中劑量組清肝祛濕活血方高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15劑量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50給藥前8.59±0.12 8.42±0.52*8.44±0.43*8.43±0.22*8.39±0.11*8.46±0.23*給藥后8.57±0.35 8.44±0.26*8.77±0.36#8.69±0.25#8.79±0.39#8.85±0.55#

表3 各組大鼠糞便中腸球菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

表3 各組大鼠糞便中腸球菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組血脂康組清肝祛濕活血方低劑量組清肝祛濕活血方中劑量組清肝祛濕活血方高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15劑量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50給藥前8.64±0.47 8.95±0.44*8.92±0.43*8.94±0.82*8.90±0.62*8.92±0.59*給藥后8.61±0.40 8.99±0.29*8.32±0.56#8.28±0.35#8.39±0.36#8.45±0.48#

表4 各組大鼠糞便中大腸桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

表4 各組大鼠糞便中大腸桿菌菌落數(shù)比較（±s） logCFU/g

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組血脂康組清肝祛濕活血方低劑量組清肝祛濕活血方中劑量組清肝祛濕活血方高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15劑量（g/kg）--0.10 5.63 11.25 22.50給藥前7.15±0.26 7.31±0.44*7.35±0.56*7.29±0.27*7.30±0.36*7.34±0.48*給藥后7.19±0.40 7.34±0.46*6.43±0.66#6.36±0.42#6.45±0.33#6.56±0.52#

3 討論

腸道菌群是一個龐大的腸道內(nèi)系統(tǒng)，是人體最大的免疫器官，大約存有1.5 千克細(xì)菌，腸道菌群的存在直接影響宿主能量代謝、營養(yǎng)及免疫等，所以常被人們稱為“第二基因組”［6］。本研究選取了大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌兩種益生菌，以及腸球菌和大腸桿菌兩種病原菌研究清肝祛濕活血方對NAFLD大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。每個宿主其疾病的發(fā)生、發(fā)展和生理代謝都受腸道菌群的影響，在此過程中腸道菌群起重要作用［7］。其中雙歧桿菌及乳酸菌對機體免疫功能、生長發(fā)育、營養(yǎng)供給、抗衰老及感染等過程發(fā)揮重要作用［8］。宿主腸道中的腸球菌和大腸桿菌屬兼性菌，不對機體健康產(chǎn)生副作用，但是如果在各種原因影響下，其遷移或增殖過程失控破壞了機體腸道菌群平衡，就會導(dǎo)致產(chǎn)生疾?。?］。

NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[10-12]。相關(guān)研究證實[13-15],血脂康治療非酒精性脂肪肝療效顯著確切，安全可靠，被臨床廣泛應(yīng)用。因此，本實驗選用血脂康作為陽性對照藥物來對比清肝祛濕活血方的治療效果。根據(jù)實驗結(jié)果，血脂康組與清肝祛濕活血方低劑量組效果相似，但無清肝祛濕活血方中、高劑組效果好。

清肝祛濕活血方中夏枯草清肝散郁；密蒙花清熱瀉火，養(yǎng)肝明目；青葙子清肝涼血；茵陳清熱利濕、退黃；垂盆草清熱解毒、利膽；丹參、郁金散結(jié)化瘀，行氣通絡(luò)。諸藥合用活血化瘀，清肝祛濕［16-17］。本研究結(jié)果顯示，清肝祛濕活血方能夠促進大鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖，抑制大腸桿菌、腸球菌增殖，說明清肝祛濕活血方具有腸道菌群調(diào)節(jié)作用。