甜菜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）超家族成員的鑒定與表達(dá)模式分析

蔣依辰，王琳玉，于清洋，邳植

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是莧科甜菜屬二年生草本植物，主要分布在我國內(nèi)蒙古和新疆自治區(qū)、黑龍江省、吉林省、寧夏回族自治區(qū)等地[1]。每年甜菜產(chǎn)糖量占我國食糖總產(chǎn)量的10%～20%，是我國主要的糖料作物[2]。鹽漬、低溫、干旱等非生物脅迫會導(dǎo)致甜菜的萌發(fā)率降低，幼苗生長狀態(tài)差，塊根發(fā)育減緩，嚴(yán)重限制了甜菜的產(chǎn)量和含糖率。因此，解析甜菜對非生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制對進(jìn)一步提高甜菜產(chǎn)量具有重要意義[3]。研究表明，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）組成的抗氧化酶系統(tǒng)是甜菜抵御非生物脅迫的重要方式之一。BvP5CS、BvCOLD1和BvCBL4等參與干旱、低溫和鹽脅迫的應(yīng)答基因也被成功克隆[4-5]。然而，目前針對甜菜的非生物脅迫研究多集中在生理、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，表觀遺傳調(diào)控如何參與甜菜非生物脅迫應(yīng)答目前研究較少。

組蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等翻譯后修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要方式之一[6]。20 世紀(jì)60年代，ALLFREY 等[7]第一次研究出乙?；鶊F(tuán)能與核心組蛋白的賴氨酸殘基連接從而產(chǎn)生乙酰化修飾，這種修飾會促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。此后，大量關(guān)于組蛋白修飾及其對染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。組蛋白的乙?；揎検怯山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）將乙酰輔酶A 中的乙?；D(zhuǎn)移到特定的賴氨酸殘基，從而中和賴氨酸側(cè)鏈的正電荷的過程。該過程會減弱組蛋白與DNA 的親和程度，增加側(cè)鏈的疏水體積，破壞氫鍵的形成能力，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，有利于轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與DNA 的結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。根據(jù)HAT 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，植物HAT 可以分為GNAT 家族、MYST 家族、CBP 家族、TAFII250 家族[9]。GNAT/MYST 超家族成員在動物、真菌和植物中具有較高的保守性。其中，GNAT家族的成員含有motif A～D 4 個(gè)特征基序，而MYST 家族僅含有特征motif A。CBP 家族成員涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期控制、分化和凋亡。與動物CBP 家族成員相比，植物CBP 家族成員缺少bromodomain、KIX、Glutamine-rich 結(jié)構(gòu)域，但具有zf-TAZ 和PHD 結(jié)構(gòu)域[10]。TAFII250 家族成員作為TFIID 轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞基，含有與其他HAT家族成員不同的乙酰化修飾結(jié)構(gòu)域[10]。

研究表明，HAT 在調(diào)控非生物對植物的脅迫中有重要的作用。擬南芥gcn5 突變體中許多熱響應(yīng)基因在被熱激后無法被正常誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致突變體表型在熱激響應(yīng)上有缺陷[11]。進(jìn)一步研究表明AtGCN5 能結(jié)合到熱響應(yīng)基因HSAF3和UVH6的啟動子上，并影響其H3K9和H3K14 的乙酰化修飾水平[12]。在鹽脅迫下，水稻的OsHAC701、OsHAC703、OsHAC704、OsHAG703和OsHAM701的轉(zhuǎn)錄水平增加，這種情況的產(chǎn)生與組蛋白H3K18乙?；脑黾佑嘘P(guān)，所以這些蛋白質(zhì)可能在水稻鹽脅迫反應(yīng)中起重要作用[13]。

目前，關(guān)于組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的研究主要是以擬南芥、玉米、水稻為主要研究對象。甜菜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（BvHATs）家族成員的研究尚未有明確報(bào)道，也不清楚在哪些BvHATs 與脅迫響應(yīng)相關(guān)。因此，本研究將利用同源比對的方法在甜菜基因組中檢索BvHATs基因家族成員；對BvHATs基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域分析；通過分析非生物脅迫下基因表達(dá)模式篩選脅迫相關(guān)的BvHATs，以期為闡明BvHATs家族基因的功能及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 不同物種基因組數(shù)據(jù)的獲取及HAT家族成員檢索

本研究從Phytozome、CoGe、URG、TAIR 等數(shù)據(jù)庫分別檢索下載擬南芥、甜菜、大豆、胡蘿卜等13 種植物的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)（表1）。以擬南芥HAT 蛋白序列進(jìn)行Blastp 檢索[14]。以E-value<1E-15 且score 值>50 為閾值[15-16]，從13個(gè)植物蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中檢索的HAT家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

表1 研究所用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)Table1 Theproteomic databaseused inthis study

1.2 HAT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析的構(gòu)建

利用Cluster Omega 對挑選出的HAT 進(jìn)行序列比對，所有參數(shù)采用默認(rèn)值[30]。隨后，利用IQ-TREE 軟件采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹[31]，基于蛋白序列比對結(jié)果以ModelFinder計(jì)算建樹最優(yōu)模型。最終，采用JTT+R5作為最優(yōu)模型構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置為1 000[32]。建樹結(jié)果使用EvolView進(jìn)行可視化[33]。

1.3 BvHATs基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

基于甜菜基因組gff 文件利用TBtools 軟件[34]從中提取HAT 基因家族成員基因組定位、外顯子和內(nèi)含子位置信息，并繪制染色體定位圖譜。HAT 基因家族成員編碼蛋白分子量和等電點(diǎn)通過Expasy 計(jì)算，蛋白功能結(jié)構(gòu)域信息則通過HMMscan進(jìn)行檢索。

1.4 非生物脅迫下BvHATs基因表達(dá)模式分析

目前SRA 數(shù)據(jù)庫中僅有鹽脅迫（PRJNA453103）和堿脅迫（PRJNA420895）后的甜菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。因此，BvHATs 基因在鹽脅迫和堿脅迫下的表達(dá)模式通過SRA 數(shù)據(jù)獲取，低溫脅迫下的表達(dá)模式利用RNA-seq 對低溫處理后甜菜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。將甜菜‘KWS9147’播種于方盆中（12 cm×12 cm×10 cm），在溫度（24±2）℃、光照強(qiáng)度為200μmol/(m2·s)、光周期16 h/8 h 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將生長24 d 的甜菜幼苗分別進(jìn)行常溫（24 ℃)和低溫（4 ℃）培養(yǎng)24 h 后剪取葉片進(jìn)行總RNA 的提取。隨后，通過RNA-seq 獲得低溫脅迫前后甜菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。鹽脅迫和堿脅迫葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)則從SRA 數(shù)據(jù)庫中獲取。鹽脅迫處理?xiàng)l件為土培澆灌含有300 mmol/L NaCl 霍格蘭營養(yǎng)液處理21 d；堿脅迫處理?xiàng)l件為水培pH9.67 堿性霍格蘭營養(yǎng)液（含50 mmol/L NaHCO3和25 mmol/L Na2CO3）處理7 d。甜菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用Salmon 對基因進(jìn)行定量，計(jì)算各轉(zhuǎn)錄本TPM值，獲得BvHATs在低溫脅迫、鹽脅迫、堿脅迫下的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 HAT家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確HAT 家族成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），7 個(gè)BvHATs 分別屬于GNAT、TAFII250 和CBP 家族。GNAT 家族含有4 個(gè)甜菜基因，CBP 家族含有2 個(gè)甜菜基因，TAFII250 家族含有1 個(gè)甜菜基因。BvHATs 常與菠菜、綠穗莧、藜麥等莧科植物HAT 位于同一亞枝，而與十字花科（擬南芥、蕪菁）、豆科（大豆、豌豆）植物常位于不同亞枝。這說明莧科內(nèi)HAT家族成員保守性較強(qiáng)，莧科HAT 可能與其他科屬植物HAT的具有不同的調(diào)控功能。

圖1 HAT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HAT gene family

2.2 BvHATs的理化性質(zhì)

BvHATs 編碼蛋白在氨基酸長度、分子量大小和等電點(diǎn)上都存在著一定的差異性（表2）。GNAT 家族成員的氨基酸數(shù)目在461～753 aa，蛋白質(zhì)分子量在51.8～83.3 kDa，蛋白等電點(diǎn)在5.32～8.73。與其他的CBP和TAFII250 家族成員相比，具有較小蛋白質(zhì)分子量，氨基酸數(shù)目均在1 000 aa以下。2個(gè)CBP家族的成員氨基酸長度均在1 500 aa 左右，分子量分別為160.8 kDa和187.9 kDa，等電點(diǎn)分別為6.53、8.53。TAFII250 家族的Bv3_058510_ugws的蛋白質(zhì)序列較長，達(dá)到1 904 aa，蛋白質(zhì)分子量為215.0 kDa，等電點(diǎn)為5.58。

表2 甜菜HAT基因家族信息Table2 Theinformationof HATfamilyin sugarbeet

2.3 BvHATs的染色體定位分析

為了解BvHATs在基因組的分布情況，利用TBtools軟件進(jìn)行了染色體定位分析，結(jié)果表明所有的BvHATs基因均位于核基因組（圖2）。Bv2_026300_ydyh定位于Chr2 染色體的上端。Bv3_058510_ugws和Bv4_085980_ujsz分別位于Chr3 和Chr4 染色體的中部位置。Bv5_120220_wckr則定位于Chr5 染色體的下端。在Chr7 染色體上分布有3 個(gè)基因，其中，Bv7_166250_wdiq定位到染色體上端，而Bv7_178170_nxgz和Bv7_178460_zusm并未確定在Chr7染色體中的具體位置。

圖2 BvHATs基因染色體定位Fig.2 The distribution of BvHATs in the chromosome

2.4 BvHATs功能結(jié)構(gòu)域分析

通過hmmscan 對BvHATs含有的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行注釋（圖3）。GNAT 家族中，Bv7_178460_zusm.t1、Bv5_120220_wckr.t1、Bv7_166250_wdiq.t1都含有Acetyltransf_1或Acetyltransf_10這兩個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域，但Bv4_085980_ujsz.t1中未注釋到相關(guān)結(jié)構(gòu)域。除Acetyltransf結(jié)構(gòu)域外，各GNAT家族成員含有的其他結(jié)構(gòu)域差異較大。Bv7_178460_zusm.t1含有兩個(gè)Radical_SAM 結(jié)構(gòu)域，可以催化包括異常甲基化、異構(gòu)化、硫插入、環(huán)形成、厭氧氧化和蛋白質(zhì)自由基形成等多種反應(yīng)。Bv5_120220_wckr.t1和Bv4_085980_ujsz.t1含有的bromodomain 結(jié)構(gòu)域能夠參與識別組蛋白賴氨酸乙?；揎棽⒋龠M(jìn)蛋白發(fā)生互作關(guān)系。CBP 家族的Bv2_026300_ydyh.t1、Bv7 178170 nxgz.t1皆含有HAT_KAT11 保守結(jié)構(gòu)域。此外，Bv7_178170_nxgz.t1在HAT_KAT11 兩端含有zf-TAZ 和ZZ 鋅指結(jié)構(gòu)，這與擬南芥等植物CBP 成員功能結(jié)構(gòu)域分布相同。Bv2_026300_ydyh.t1兩端缺少zf-TAZ和ZZ，但含有PHD 鋅指結(jié)構(gòu)。TAFII250家族成員Bv3_058510_ugws.t1含有保守的TFIID 轉(zhuǎn)錄因子亞基，并在其上游和下游分別含有ubiquitin 泛素化修飾結(jié)構(gòu)域和bromodomain 結(jié)構(gòu)域。這與擬南芥TAFII250亞家族具有相同的結(jié)構(gòu)域特征。此外，Bv3_058510_ugws.t1還在N末端含有TATA盒結(jié)合蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TBP-bindingdomain），可能在調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)中具有一定功能。

圖3 BvHATs功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Analysis of function domain in BvHATs

2.5 非生物脅迫下BvHATs表達(dá)模式分析

對BvHATs 家族基因在鹽脅迫、堿脅迫和低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果表明，BvHATs家族基因在不同非生物脅迫下呈現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律。在鹽脅迫下，各個(gè)BvHATs 表達(dá)量均未發(fā)生顯著變化。其中，Bv4_085980_ujsz在不同鹽脅迫樣品中表達(dá)量差異較大，部分樣品中TPM 值為2～3，而在一些重復(fù)中TPM 值為0。除Bv3_058510_ugws、Bv7_166250_wdiq上調(diào)不顯著外，其余BvHATs均在堿脅迫后表達(dá)量顯著上調(diào)，但僅有Bv4_085980_ujsz變化倍數(shù)超過2 倍。在冷脅迫下，CBP家族基因Bv2_026300_ydyh表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖4 不同脅迫下BvHATs的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of BvHATs under various stresses

3 討論與結(jié)論

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶是一種重要的酶類，在轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、修復(fù)等生理過程中起到很大作用[35]。HAT一共含有GNAT、MYST、CBP 和TAFII250四個(gè)基因家族[36]。通過比對擬南芥中已知HAT序列，在甜菜基因組中共鑒定到7 個(gè)BvHATs。從基因數(shù)目和系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果來看，GNAT 和TAFII250 家族基因在莧科和十字花科分化后沒有出現(xiàn)明顯的基因加倍事件，而擬南芥CBP 家族成員數(shù)目（5 個(gè)）明顯多于甜菜（2 個(gè)）。同時(shí)，甜菜中缺少M(fèi)YST 家族成員。這些結(jié)果暗示甜菜和擬南芥HAT 在調(diào)控生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中可能存在一定差異。

研究表明，AtGCN5 能夠與CBF1、DREB2A、AREB1～2 等脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成蛋白復(fù)合體，催化H3K9、H3K14、H3K27、H4K4、H4K5 位點(diǎn)的乙?；揎梉37-39]。此外，AtHAC1、AtHAF2等基因也被發(fā)現(xiàn)參與鹽脅迫、低溫、光脅迫等應(yīng)答過程[40]。BvHATs 是否參與鹽脅迫和低溫等應(yīng)答過程值得探究。為此我們通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和非生物脅迫下基因表達(dá)模式分析尋找可能的非生物脅迫應(yīng)答B(yǎng)vHATs。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，篩選出Bv5_120220_wckr為AtGCN5的直系同源基因。但是系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明莧科植物與十字花科植物HAT分別形成不同亞枝，暗示其基因功能存在一定差異。根據(jù)不同脅迫下的表達(dá)特性分析可知，Bv5_120220_wckr僅在堿脅迫中基因水平顯著上調(diào)，所以Bv5_120220_wckr是否參與甜菜鹽漬、低溫等脅迫仍需進(jìn)一步研究?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)BvHATs在鹽堿和低溫脅迫中表達(dá)模式發(fā)生顯著變化。特別是CBP 家族基因Bv2_026300_ydyh在低溫脅迫后表達(dá)量顯著下調(diào)，暗示其參與低溫應(yīng)答過程。而Bv4_085980_ujsz和Bv7_178170_nxgz響應(yīng)堿脅迫。這與擬南芥中低溫、鹽脅迫等多個(gè)非生物脅迫響應(yīng)均由At-GCN5參與調(diào)控不同，甜菜中不同脅迫的應(yīng)答可能由不同HAT 成員參與。綜上，本研究為進(jìn)一步闡明BvHATs功能及其調(diào)控機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)信息。