馬鈴薯組織中SGAs含量差異及其基因表達(dá)分析

李紅艷，李潔雅，葉廣繼，2，3，4，5，蘇 旺，2，3，4，5，周 云，2，3，4，5，王 艦，2，3，4，5

(1.青海大學(xué)，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；3.青海大學(xué)青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4.青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；5.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

【研究意義】糖苷生物堿(Steroidal glycoalkaloids，SGAs)是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于茄科和百合科植物中[1-2]。馬鈴薯栽培種含有50多種SGAs，95%以上是α-茄堿和α-卡茄堿[3-5]。馬鈴薯塊莖中，SGAs主要分布在1.5 mm厚的皮層下[6]。全球種植5000多個(gè)馬鈴薯品種，因品種及貯藏方式不同，各個(gè)馬鈴薯之間SGAs含量差異較大[7]。馬鈴薯中SGAs含量在20 mg/100 g(鮮質(zhì)量)、1 mg/g(干質(zhì)量)范圍內(nèi)可以安全食用，達(dá)到20 mg/100 g會(huì)引起中毒，高于30～60 mg/100 g則會(huì)致死[8-11]。SGAs不僅對(duì)植物具有一定的防御作用，而且它能抑制人體內(nèi)膽堿酯酶的活性[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，SGAs具有抗癌、抗炎、抗菌等藥理活性，其中α-卡茄堿的藥理活性是α-茄堿的2倍[16-19]。但馬鈴薯中SGAs含量過多，其毒性會(huì)破壞人體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，危害正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響馬鈴薯的安全食用和生產(chǎn)加工。【前人研究進(jìn)展】關(guān)于馬鈴薯中SGAs的研究已有許多報(bào)道，Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，樟腦可抑制馬鈴薯塊莖的發(fā)芽，從而降低SGAs的積累，孟衛(wèi)芹等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通風(fēng)、低氧等條件下可延遲馬鈴薯發(fā)芽，使SGAs積累減少，霍權(quán)恭等[22]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯貯藏時(shí)間越長，SGAs積累越多。SGAs來源于膽固醇，膽固醇經(jīng)過多次羥基化、氧化和轉(zhuǎn)胺化反應(yīng)，最終生成α-茄堿和α-卡茄堿[23]。馬鈴薯莖和塊莖等生長旺盛的組織中容易合成SGAs，其生物合成分為萜類、甾醇類與茄啶三個(gè)階段，合成過程中所需要的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因(如StSGT和StSSR2等)已有研究報(bào)道[24-26]。馬鈴薯作為主糧作物，其塊莖不僅供人類食用，也可用于薯片、薯?xiàng)l等加工。目前，國內(nèi)在選育馬鈴薯品種時(shí)對(duì)產(chǎn)量、抗病性、淀粉含量等性狀關(guān)注較多，但是塊莖中SGAs含量缺乏系統(tǒng)的檢測及評(píng)價(jià)，可能是因?yàn)镾GAs的檢測需要專業(yè)設(shè)備和人力物力。【本研究切入點(diǎn)】隨著主糧化的進(jìn)程，我國馬鈴薯人均消費(fèi)量將增加，馬鈴薯的食用安全需得到保障。儲(chǔ)藏條件會(huì)使馬鈴薯塊莖的品質(zhì)發(fā)生較大改變，例如低溫糖化、變綠發(fā)芽都會(huì)影響馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選育塊莖中低SGAs含量的馬鈴薯是今后育種的主要方向之一，而且SGAs具有藥理活性，馬鈴薯芽中SGAs含量高，部分馬鈴薯資源塊莖長期儲(chǔ)藏后SGAs含量增加，無法食用，均可作為提取SGAs的原料，為馬鈴薯的綜合利用提供新思路以及為馬鈴薯的安全食用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯資源1-76、6-36、5-36、6-1來自青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品用40%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)配制成400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再分別將標(biāo)準(zhǔn)中間液用40%的甲醇逐步稀釋成4 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用40%甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為25、50、100、200、300、400、500、600 ng/mL的混合液，過0.22 μm濾膜后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品處理 取地窖貯藏60 d的紫皮馬鈴薯資源(1-76、6-36)和白皮馬鈴薯資源(5-36、6-1)的塊莖，光照60 d后的發(fā)芽馬鈴薯芽冷凍干燥后研磨。分別稱取塊莖和芽樣品粉末0.2 g，加入5%的乙酸5 mL，渦旋混勻后超聲處理30 min，8000 r/min離心5 min后收集上清液，上清液用40%的甲醇稀釋50或500倍，過0.22 μm濾膜，待測。

使用美國Agilent公司生產(chǎn)的Agilent 1260 InifityⅡ-Agilent 6470高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測α-茄堿和α-卡茄堿含量。α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。

1.3 SGAs生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)SGAs合成通路，選取StHMG1，StSQS1，StCAS，StSSR2，StGAME4，StGAME8a，StSGT1，StSGT2，StSMT1和StCYP51G等結(jié)構(gòu)基因，送上海生物工程公司合成。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA的合成 采用TaKaRa提取試劑盒提取馬鈴薯資源1-76、6-36、5-36、6-1塊莖和芽中的總RNA(圖1)。

M. DL2000；1～4為馬鈴薯塊莖(1-76、6-36、5-36、6-1)的RNA；5～8為馬鈴薯芽(1-76、6-36、5-36、6-1)的RNAM. DL2000; 1-4 is the RNA of potato tubers (1-76, 6-36, 5-36, 6-1);5-8 is the RNA of potato buds (1-76, 6-36, 5-36, 6-1)圖1 馬鈴薯塊莖、芽RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoresis of potato tubers and buds

cDNA的合成參照5×Prime Script TMRT Master Mix(Perfect RealTime)(TaKaRa)說明書進(jìn)行，整個(gè)過程在冰上。反應(yīng)體系20 μL：5×Prime Script RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，總 RNA體積等于1000除以RNA濃度，用RNase Free ddH2O補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 3 s，4 ℃無限循環(huán)。將得到的cDNA溶液稀釋至200 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qRT-PCR檢測 以cDNA為模板，Actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，引物-F(10 μmol/L)0.4 μL，引物-R(10 μmol/L)0.4 μL，TB Green premix Ex Taq II 10 μL，ddH2O 7.2 μL。Real Time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，61 ℃ 32 s, 40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，55 ℃ 10 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種馬鈴薯資源在不同儲(chǔ)藏條件下的表型變化

對(duì)4種馬鈴薯資源分別進(jìn)行地窖和光照儲(chǔ)藏60 d(圖2)后，地窖貯藏的馬鈴薯開始發(fā)芽，而光照下的馬鈴薯芽長至1.5 cm左右，皮色發(fā)綠。推測由于儲(chǔ)藏溫度對(duì)馬鈴薯的表型有一定影響。

a為地窖貯藏60 d，b為光照貯藏60 da is cellar storage for 60 days, b is light storage for 60 days圖2 4種馬鈴薯資源儲(chǔ)藏60 d后的變化Fig.2 Changes of four kinds of potato resources after storage for 60 days

2.2 糖苷生物堿含量分析

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定顯示，馬鈴薯塊莖中SGAs含量變化范圍為0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量變化范圍為24.518～41.579 mg/g。2種紫皮馬鈴薯資源(1-76、6-36)塊莖和芽中的SGAs含量變化無顯著差異，2種白皮馬鈴薯資源(5-36、6-1)中SGAs含量在塊莖中差異性顯著，但在芽中差異不顯著(表1)。因此，選用2種白皮馬鈴薯資源為試驗(yàn)材料進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)性分析。

2.3 SGAs生物合成相關(guān)基因在馬鈴薯資源中的表達(dá)量分析

使用qRT-PCR方法檢測了2種白皮馬鈴薯資源(5-36、6-1)SGAs合成途徑中StHMG1，StSQS1，StCAS，StSSR2，StGAME4，StGAME8a，StSGT1，StSGT2，StSMT1和StCYP51G10個(gè)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。塊莖中，SGAs含量5-36顯著高于6-1(表1)，StCAS，StSSR2，StGAME4，StSGT1，StSGT2和StSMT1這6個(gè)基因的表達(dá)量5-36顯著高于6-1，其他基因在5-36中的表達(dá)量低于或接近6-1(圖3-a)；芽中，SGAs含量5-36略高于6-1，表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，除了StSMT1基因外，其他9個(gè)基因的表達(dá)量在5-36顯著高于6-1(圖3-b)。通過基因表達(dá)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SGAs生物合成途徑中部分基因(StCAS，StSSR2，StGAME4，StSGT1，StSGT2)的表達(dá)量與SGAs含量之間的關(guān)系密切。

表1 不同馬鈴薯資源塊莖、芽中的SGAs含量

圖3 SGAs生物合成相關(guān)基因在馬鈴薯資源(5-36、6-1)塊莖(a)和芽(b)中的表達(dá)量變化Fig.3 Changes in expression of SGAs biosynthesis-related genes in potato resources (5-36, 6-1) tubers (a) and buds (b)

由表1可知，所有馬鈴薯芽中的SGAs含量顯著高于塊莖。在馬鈴薯資源5-36塊莖和芽不同組織中，參與SGAs合成的相關(guān)基因表達(dá)量存在差異，其中StHMG1，StSSR2和StGAME8a基因的表達(dá)量在芽組織中高于塊莖，其他基因的表達(dá)則相反或相近。然而在馬鈴薯資源6-1塊莖和芽不同組織中，基因表達(dá)量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有StSSR2和StGAME8a基因的表達(dá)量在芽中顯著高于塊莖，其他基因在芽中的表達(dá)量低于塊莖或二者相當(dāng)(圖4)。表明不同馬鈴薯資源在調(diào)控不同組織SGAs的合成途徑中存在共同機(jī)制，但有細(xì)微差別。此外，參與SGAs合成的部分基因可能參與了其他生物合成過程。

圖4 SGAs生物合成相關(guān)基因在5-36(a)和6-1(b)塊莖和芽中的表達(dá)量變化Fig.4 Changes in expression of SGAs biosynthesis-related genes in 5-36(a) and 6-1(b) tubers and buds

3 討 論

馬鈴薯中SGAs具有多種生物學(xué)功能，尤其馬鈴薯塊莖中其含量過高將影響食用安全，因此SGAs合成調(diào)控機(jī)理一直以來是研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)中，不同馬鈴薯資源塊莖和芽中的SGAs含量差異較大，這與前人研究結(jié)果相符[27-29]。測定的不同馬鈴薯資源塊莖中α-茄堿含量為0.016～1.593 mg/g，α-卡茄堿含量為0.018～1.766 mg/g，馬鈴薯資源芽中α-茄堿含量為10.812～19.047 mg/g，α-卡茄堿含量為13.706～22.533 mg/g，α-卡茄堿含量比α-茄堿含量高，符合前人研究結(jié)果[30-31]。4個(gè)馬鈴薯資源塊莖中SGAs含量為0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量為24.510～41.579 mg/g，在儲(chǔ)藏60 d后有2個(gè)馬鈴薯資源1-76(0.123 mg/g)和6-1(0.034 mg/g)塊莖中的SGAs含量未超出安全食用范圍(1 mg/g)(干質(zhì)量)，其余馬鈴薯資源塊莖和芽中的SGAs含量均已超出安全食用標(biāo)準(zhǔn)。

SGAs的合成是通過甲羥戊酸途徑實(shí)現(xiàn)的，其中羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG1)基因是SGAs甲羥戊酸合成途徑中的第一步催化酶，馬鈴薯塊莖中SGAs含量與HMGR和鯊烯合成酶(PSS1/SQS)基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[32]，但本試驗(yàn)結(jié)果中StHMG1基因的表達(dá)量與SGAs含量變化規(guī)律不一致，實(shí)驗(yàn)材料的不同是造成與前人研究存在差異的原因之一，StHMG1基因在馬鈴薯中以基因家族的形式存在，但是該家族中不同基因的功能存在差異。環(huán)阿屯醇合成酶(CAS1)位于2,3-環(huán)氧化鯊烯合成環(huán)阿屯醇的分支點(diǎn)，StCAS基因表達(dá)量在不同資源中與SGAs含量變化規(guī)律一致，但是StCAS基因表達(dá)量在同一資源不同組織中與SGAs變化規(guī)律相反，SGAs含量低的塊莖中，該基因的表達(dá)量高，推測其不僅參與SGAs的生物合成過程，還參與了其他生物合成過程。馬鈴薯甾醇側(cè)鏈還原酶2(StSSR2)是以環(huán)丙烯醇為原料合成SGAs的前體膽固醇的關(guān)鍵酶，位于茄堿和油菜素內(nèi)酯合成的分支點(diǎn)，其不僅催化甾醇類物質(zhì)合成，而且同家族的StDWF1基因催化油菜素內(nèi)酯合成[33-34]。本試驗(yàn)中，StSSR2基因主要在馬鈴薯芽中表達(dá)，塊莖中幾乎不表達(dá)，并且，在SGAs含量高的馬鈴薯資源(5-36)不同組織中，該基因的表達(dá)量均高于SGAs含量低的馬鈴薯資源(6-1)，表明該基因可能主要負(fù)責(zé)馬鈴薯SGAs的合成。此外，敲除或沉默StSSR2基因均可以降低馬鈴薯中SGAs含量[35-37]。

研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中StSSR2基因主要在塊莖和莖中表達(dá)，葉片次之，根和匍匐莖中表達(dá)量最少[38]，但在芽中還未見報(bào)道，StSSR2基因的功能有待進(jìn)一步深入研究。細(xì)胞色素P450單加氧酶基因(Glycoalkaloid Metabolism 4，GAME4)催化SGAs生物合成途徑下游的生化反應(yīng)，沉默該基因使馬鈴薯塊莖中SGAs含量顯著降低[39-40]。本研究中，StGAME4基因的表達(dá)模式與StCAS基因一致，同一資源不同組織中該基因的表達(dá)量與SGAs含量變化規(guī)律相反。SGAs生物合成過程中的糖基化過程由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(SGT1)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(SGT2)催化合成。安然等[41]研究發(fā)現(xiàn)SGT1、SGT2和SGT3基因被敲除后，馬鈴薯塊莖中SGAs含量降低。McCue等[42]抑制StSGT1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)塊莖中的α-茄堿幾乎被完全抑制，但α-卡茄堿的積累水平卻提高了，導(dǎo)致總體SGAs的含量沒有太大改變。本試驗(yàn)結(jié)果表明，StSGT1，StSGT2基因表達(dá)模式與StCAS基因一致，推測這2個(gè)基因負(fù)責(zé)不同馬鈴薯資源中SGAs含量，而對(duì)同一資源不同組織中SGAs含量貢獻(xiàn)較小。甾醇C-24-甲基轉(zhuǎn)移酶1(SMT1)作為植物甾醇類生物合成分支的關(guān)鍵酶，將環(huán)丙烯醇轉(zhuǎn)化為24-亞甲基環(huán)丙烯醇，前人研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯中過表達(dá)大豆中GmSMT1基因，葉片和塊莖中總SGAs及游離膽固醇含量顯著下降，與SGAs含量改變一致[43]。然而，本實(shí)驗(yàn)中StSMT1基因的表達(dá)量與SGAs含量變化規(guī)律存在差異。鈍葉醇14-α-去甲基化酶(StCYP51G)主要參與馬鈴薯中植物甾醇(菜油甾醇和谷甾醇)的生物合成，StCYP51G基因在不同馬鈴薯資源塊莖和芽中的表達(dá)量與SGAs含量變化規(guī)律相關(guān)性不高。

4 結(jié) 論

4種馬鈴薯芽中的SGAs含量顯著高于塊莖，塊莖中SGAs含量變化為0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量變化為24.510～41.579 mg/g，4種馬鈴薯芽及馬鈴薯6-36(0.272 mg/g)和5-36(3.360 mg/g)塊莖中的SGAs含量均已超出安全食用值(1 mg/g，干質(zhì)量)，對(duì)人類安全食用存在風(fēng)險(xiǎn)。不同馬鈴薯資源中，SGAs的調(diào)控機(jī)制與不同組織中SGAs合成機(jī)制可能存在差異，為深入解析不同馬鈴薯資源中SGAs的合成機(jī)理以及馬鈴薯的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。