阿司匹林抵抗和缺血性腦卒中的相關性研究

李植燦，姚慶陽，王燦明，黃清宇

福建省泉州市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建泉州 362000

缺血性腦卒中在中老年人群中是一種發(fā)病率較高的腦血管疾病[1]。該病發(fā)作突然，病情進展快速，如不及時治療，可引起患者殘疾或死亡。目前臨床上主要通過抗血小板藥物對該病進行治療，可有效控制缺血性腦卒中患者的病情進展。阿司匹林是一種常用的抗血小板藥物，但近些年來隨著該藥物的廣泛的應用，有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，部分患者服用阿司匹林后無法有效降低缺血性腦卒中復發(fā)風險，同時指出這可能與阿司匹林抵抗（aspirin resistance, AR）現(xiàn)象有關[2]。近些年來隨著基因技術的發(fā)展進步，有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林是一種非選擇性環(huán)氧合酶（cyclooxygenase, COX）抑制劑，能與COX進行反應使酶失去活性，從而對花生四烯酸（arachidonic acid, AA）進行有效抑制，使血小板在血栓素A2（thromboxaneA2, TXA2）介導下發(fā)生的聚集現(xiàn)象被阻斷[3]。阿司匹林能不可逆地抑制COX-1 與COX-2，但對COX-1 具有更強的抑制效果，因此，其對COX-1 的抑制程度在很大程度上決定了其抗栓效果。近些年隨著對COX 基因多態(tài)性研究的深入，有研究指出AR 現(xiàn)象可能與COX-1 受體上-1676A＞G 及COX-2 基因啟動子區(qū)的-765G/C 多態(tài)性有關[4]?；诖?，本文方便選取2018 年1 月—2020 年9 月在泉州市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的258 例缺血性腦卒中患者為研究對象，對其AR 與缺血性腦卒中之間的相關性進行了研究分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取于本院神經(jīng)內(nèi)科住院的258 例缺血性腦卒中患者為研究對象，所有患者入院后均進行磁共振檢查發(fā)現(xiàn)新的腦梗死病灶，并根據(jù)GUM標準：采用10 μmol/L 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）對血小板進行誘導，AS 為血小板聚集率＜70%，AR 為血小板聚集率≥70%。其中，AS 組170 例，AR 組88 例。阿司匹林敏感（Aspirin sensitivity, AS）組中男105 例，女65 例；年齡49～79 歲，平均（65.24±3.87）歲；體質(zhì)指數(shù)（body mass index, BMI）19.89～32.14 kg/m2，平均（25.99±3.05）kg/m2；吸煙患者66 例，不吸煙患者104 例；高血壓病患者104 例（61.18%）；糖尿病患者58 例（34.12%）。AR 組中男58 例，女30 例；年齡51～80 歲，平均（66.08±3.91）歲；BMI 20.13～32.89 kg/m2，平均（26.11±3.09）kg/m2；吸煙患者34 例，不吸煙患者54 例；高血壓病患者55例（62.5%）；糖尿病患者24 例（27.27%）。兩組患者基本臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①年齡49～80 歲者；②已簽署知情同意書者；③病情穩(wěn)定可控，精神狀態(tài)良好，能夠積極配合完成本次研究者。排除標準：①各種原因，中途要求自動退出者；②阿司匹林過敏者；③合并嚴重消化性潰瘍、出血者；④合并急慢性血液系統(tǒng)疾病者；⑤合并重癥高血壓、房顫者；⑥合并嚴重肝腎功能不全者；⑦近期合并腦出血、腦外傷及手術者；⑧長期酗酒者。

1.3 方法

①光比濁法測定血小板集聚率：抽取全血放置在枸櫞酸鈉抗凝管中，用以 500 r/min 的離心機，離心 5 min，提取上層富含血小板的血漿（platelet rich plasma, PRP）。將剩余血液標本再次以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 15 min，提取上層貧血小板血漿（platelet poor plasma, PPP），用作實驗校正。200 μl PRP 放置在樣品方杯中，200 μlPPP 放置于校正方杯中，恒溫預熱3 min。儀器調(diào)至TEST 狀態(tài)，進行儀器檢測零點校正，待數(shù)值穩(wěn)定后，往杯底加入10 μmol/L ADP 5μl，進行血小板聚集率測試。據(jù)GUM 標準：用10 μmol/L ADP 誘導的血小板聚集率≥70%定義為AR，血小板聚集率＜70%定義為阿司匹林敏感。

②DNA 提?。禾崛〕科鹂崭够颊哽o脈血2 mL，放置保存在枸櫞酸鈉抗凝管中，用DNA 提取試劑盒提取全血中的DNA，并于-20℃環(huán)境下進行保存。

③聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）及DNA 測序：首先從把COX-1、COX-2 基因變異位點從HapMap 中國漢族人群數(shù)據(jù)庫中提取出來。以0.05 為最小等位基因頻率（minor allele frequency, MAF）下限，利用獲取的變異位點以r2＞0.8原則對tag SNP 進行鑒別挑選。對COX-1 -1676A＞G 引物、COX-2 上765G/C 引物進行擴增處理。完成后對PCR 產(chǎn)物進行DNA 測序檢測。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。另使用Pearon Chi-Square 對基因型及表型進行檢測，之后使用Hapviewer 軟件對基因位點是否出現(xiàn)連鎖不平衡現(xiàn)象進行計算。

2 結果

2.1 兩組Hard-Weinberg 平衡檢驗

258 例患者血液DNA 檢測結果顯示，在COX-1 -1676A＞G 位點中，AA 純合子、AG 雜合子、GG 突變 純合 子 分 別 為90 例、131 例、37 例；在COX-2-765G/C 位點中，GG 純合子、GC 雜合子分別為221例、37 例，CC 突變純合子未發(fā)現(xiàn)。COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 等位基因頻率分別符合Hard-Weinberg 平衡檢驗，樣本有廣泛代表性。見表1。

表1 所選位點的基因型頻率分布及Hard-Weinberg 平衡檢驗Table 1 Genotype frequency distribution and Hard-Weinberg equilibrium test for selected loci

2.2 兩 組 患 者COX-1 -1676A＞G 及COX-2-765G/C 位點基因型分布比較

AS 組與AR 組COX-1 -1676A＞G 位點G 等位基因攜帶及COX-2 -765G/C 位點C 等位基因攜帶相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 位點基因型分布對比[n(%)]Table 2 Comparison of genotype distribution of COX-1 -1676A＞G and COX-2 -765G/C loci between the two groups of patients[n(%)]

2.3 兩組患者終點事件發(fā)生率比較

兩組258 例患者共出現(xiàn)42 例終點事件，占比16.28%。 其 中 死 亡3 例（1.16%），腦 出 血5 例（1.94%），心肌梗死3 例（1.16%），缺血性腦卒中復發(fā)31 例（12.02%）。其中，AR 組缺血性腦卒中復發(fā)率明顯高于AS 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組終點事件發(fā)生率對比[n(%)]Table 3 Comparison of the incidence of end-point events between the two groups[n(%)]

2.4 兩組患者臨床預后與COX-1-1676A＞G、COX-2-765G/C 基因型相關性分析

COX-1-1676A＞G 其G 等位基因攜帶和缺血性腦卒中復發(fā)相比存在相關性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）；COX-2-765G/C 其C 等位基因攜帶與缺血性腦卒中復發(fā)均無相關性（OR=5.71，95%CI=1.11～29.55，P＞0.05）。見表4。

表4 兩組患者臨床預后與COX-1 -1676A＞G、COX-2 -765G/C基因型相關性分析Table 4 Correlation analysis between clinical prognosis and COX-1-1676A ＞G and COX-2-765g /C genotypes in the two groups

3 討論

本研究結果顯示：AR 組缺血性腦卒中復發(fā)率明顯高于AS 組（P＜0.05），提示缺血性腦卒中復發(fā)與AR 存在密切聯(lián)系。近些年來基因技術的重大突破，為臨床相關方面的研究開辟了一條新途徑，即從分子流行病學角度對心腦血管疾病與基因變異之間存在的聯(lián)系進行研究，并且已有研究在某些方面已經(jīng)證實AR 與遺傳的基因易感性存在密切聯(lián)系[5-6]。因此對人群中的AR 易感性基因進行篩查可指導和幫助臨床上更好地識別和防治高危人群。AR 具有較為復雜的發(fā)病機制，且肥胖、吸煙等內(nèi)外多種因素均會對其發(fā)生產(chǎn)生影響，其作用機制主要是通過對患者基線狀態(tài)下血小板活性產(chǎn)生影響，從而對抗血小板治療反應性進行影響。而本研究納入的兩組患者的臨床基本資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此，在本研究中可以將基線狀態(tài)下混雜因素對阿司匹林敏感性的干擾排除，所以本文主要對阿司匹林治療效果與COX-1、COX-2 基因之間存在的關系進行研究分析。

目前國內(nèi)外并無統(tǒng)一的標準來檢測AR，主要有：血栓彈力圖檢測、電阻抗聚集度法測定、光比濁法測定、血小板功能分析儀、出血時間測定、血清TXA2 及其代謝物含量測定法、Verify Now 系統(tǒng)等[7]。但這些方法都各有利弊，在一定程度上會受到特異性和/或敏感性方面的固有的偏差影響。根據(jù)國內(nèi)外的一些報告，不同的檢測方法，其AR 的發(fā)生率在5%～60%之間[8]。本研究通過光比濁法測定發(fā)現(xiàn)AR 的發(fā)生率為34.1%。

本研究結果顯示AR 組COX-1-1676A＞G 位點G 等位基因攜帶頻率達71.59%，高于AS 組的61.76%，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對258 例患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)腦梗死復發(fā)的患者中GA+GG 基因型頻率達87.1%，未復發(fā)組達62.1%，且COX-1-1676A＞G 其G 等位基因攜帶和缺血性腦卒中復發(fā)之間存在相關性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）。這一研究結果與張萃藝等[9]的研究相一致，服用阿司匹林但仍發(fā)生腦缺血性事件的概率達到70.23%，與由于1676A＞G 基因突變型存在明顯相關性（OR=0.26），并提出這可能是1676A＞G 攜帶的G 等位基因提高COX-1 RNA 的表達，增加蛋白質(zhì)的合成，促進TXA2 的合成，促使血小板大量聚集形成血栓。根本原因是COX-1-1676A＞G 基因在中國漢族人群中比較常見，在我國心腦血管疾病患者中阿司匹林耐藥性與COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因變異體密切相關[10]。李虓等[11]通過調(diào)查431 例服用阿司匹林的老年漢族心腦血管疾病患者的COX-1 基因中單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphisms, SNP）與AR 的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因可增加AR 的發(fā)病風險。但有研究發(fā)現(xiàn)，AR 的發(fā)生與COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因不相關。李霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因并未增加AR 的發(fā)生，未增高缺血性腦卒中的復發(fā)率。

COX-2 基因位于1 號染色體上，與COX-1 相比，COX-2 主要在炎癥反應中起作用[13]，可將AA 轉(zhuǎn)化成TXA2，從而促進血小板聚集。有報告認為COX-2-765C 等位基因的突變可能降低阿司匹林的敏感性而造成AR[14]。袁凌[15]通過對450 例缺血性卒中患者進行3 個月隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)攜帶COX-2-765C 等位基因的患者AR 的發(fā)生率更高，其預后不良。但楊秀峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)COX-2-765G/C 突變基因型并未增加缺血性腦卒中及心肌梗死的風險。本研究結果顯示：AS 組COX-2-765G/C 基因攜帶C等位基因的頻率為11.18%，與其相比，AR組COX-2-765G/C基因攜帶C等位基因的頻率更高（20.46%）；對比AS組患者發(fā)生腦梗死（8.82%），AR 組更容易發(fā)生腦梗死（18.18%）（P＜0.05）。

綜上所述，本研究顯示AR 與缺血性腦卒中復發(fā)明顯相關，但是未來還需要對缺血性腦卒中患者發(fā)生AR 與COX-2-765G/C 基因及COX-1-1676A＞G基因之間的相關性進行進一步研究，并且可以選取其他SNP 位點作為研究對象，從而對AR 的基因變異特性進行更加全面的了解，進而為臨床治療提供借鑒和參考。