門冬胰島素干粉包材中脂肪酸遷移研究

高 偉

（霍尼韋爾自動(dòng)化控制（中國）有限公司，上海 201203）

隨著市場藥物種類的增多，其藥效與質(zhì)量直接關(guān)系到人身健康和安全。除了保證藥品本身的質(zhì)量和安全，維持藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存的質(zhì)量同樣重要。藥包材作為與藥品直接接觸部分，對藥品的穩(wěn)定性起著重要作用，因此藥包材將直接影響用藥的安全性[1]。橡膠塞化學(xué)穩(wěn)定性好，具有耐酸、堿和極性溶劑的特點(diǎn)。氣密性、耐候性、耐熱性、生物性能良好等優(yōu)點(diǎn)，常作為藥品密封，為藥品質(zhì)量提供可靠的保證[2]。藥用橡膠塞在生產(chǎn)過程中配方復(fù)雜，經(jīng)常會使用硫化劑，促進(jìn)劑，硫化活性劑。這些助劑能大大提高其加工性能，但不可避免在膠塞中會有殘存。特別是在高溫滅菌時(shí)，會使其遷移到膠塞表面，在藥品的運(yùn)輸、儲存中與藥品發(fā)生相互作用，從而影響藥品的質(zhì)量。硬脂酸是常用的有機(jī)硫化活性劑[3]，在橡膠的合成和加工過程中起著重要作用。脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)素，其中棕櫚酸和硬脂酸含量最大的飽和脂肪酸。大量流行病研究證實(shí)[4]，過多的攝入飽和脂肪酸是導(dǎo)致心血管疾病的因素，膳食中攝入飽和脂肪酸越多，血清總膽固醇水平越高，心血管疾病發(fā)病率越高。

相容性研究為了驗(yàn)證密封件與藥品之間沒有發(fā)生嚴(yán)重的相互作用，不會導(dǎo)致藥品有效性和穩(wěn)定性發(fā)生改變，或者產(chǎn)生安全性風(fēng)險(xiǎn)的過程?；瘜W(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則規(guī)定[5]，硬脂酸作為活性劑，其遷移量是橡膠類注射組件的考察項(xiàng)目之一。脂肪酸和棕櫚酸常以混合物形式存在[6]，因此本文以硬脂酸和棕櫚酸為考察對象進(jìn)行驗(yàn)證。利用正己烷萃取遷移至藥液中的痕量硬脂酸和棕櫚酸，乙酰氯-甲醇甲酯[7]化后富集，通過 GC-MS 測定。從線性、檢出限和定量限、專屬性、重復(fù)性和中間精密度、回收率幾個(gè)方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[8]，為后續(xù)的穩(wěn)定性提供方法指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：硬脂酸甲酯（C18 : 0）（AccuStandard, SFA-011N, 99.7%）、棕櫚酸甲酯（C16 : 0）（AccuStandard, SFA-009N, 100.00%）、十一酸甲酯（C11 : 0）（AccuStandard, 100.00%, SFA-004N）、棕櫚酸（BePure, 99%）、硬脂酸（BePure, 99%）、十一酸（Anpel, 100%）、乙酰氯（國藥集團(tuán)，99%）、門冬胰島素干粉（購于藥店）。

實(shí)驗(yàn)儀器：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫 7890B&5975C）、氮吹儀（安譜科學(xué)儀器有限公司）、氮?dú)獍l(fā)生器（上海登晨生物醫(yī)療科技有限公司）、回旋振蕩器（國華電器有限公司）、電熱恒溫震蕩水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制：配制 100 μg·mL-1十一酸甲酯正己烷溶液，1.0 μg·mL-1硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的正己烷混合溶液。10 μg·mL-1硬脂酸和棕櫚酸混合加標(biāo)甲醇溶液備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度分別為 0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、1.8 μg·mL-1，1.0 μg·mL-1十一酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，正己烷定容。

標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)物的配制：配制 10 μg·mL-1十一酸的甲醇溶液，10 μg·mL-1的硬脂酸和棕櫚酸甲醇溶液。

1.3 樣品方法學(xué)處理

方法學(xué) 1：取三個(gè)不同批次的門冬胰島素干粉各 7 瓶于 50 mL 量瓶中，超純水定容至刻度，記為 A。

取樣品溶液 3.0 mL，同法制備 5 份，依次分別加入 10 μg·mL-1的十一酸溶液 0.20 mL，10 μg·mL-1硬脂酸和棕櫚酸混合溶液 0.20 mL，1.0 g NaCl 混勻，滴加入 0.50 mL 50% H2SO4，加入 20 mL 正己烷振蕩，取其中上層正己烷溶液 12 mL 至 40 mL 玻璃瓶，記為 A1-A6 中。加入 10 mL MeOH，慢慢滴加入 0.50 mL 乙酰氯，擰緊蓋子，85℃ 甲酯化 1 h，冷卻至室溫后加入 10 mL 水振蕩分層，取其上層正己烷 10 mL，氮吹至 1 m 以下，定容至 1 mL。同法制備空白樣，記為 A0。

方法學(xué) 2：混樣同方法學(xué) 1，同樣取樣品溶液 3.0 mL 于 40 mL 玻璃瓶中，同法制備 10 份，記為 B1～B10。分別加入 10 μg·mL-1的十一酸溶液 0.20 mL，樣品 B2～B4、B5～B7、B8～B10 中分別加入 10 μg·mL-1的硬脂酸和棕櫚酸混標(biāo)中間液 0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL，其他步驟同 A。同法制備空白樣，記為 B0。

1.4 測試樣品處理

取三個(gè)不同批次的門冬胰島素干粉各 7 瓶于 50 mL 量瓶中，超純水定容至刻度。取樣品溶液 3.0 mL，加入 10 μg·mL-1的十一酸溶液 0.20 mL，1.0 g NaCl 混勻，滴加入 0.50 mL 50% H2SO4，加入 20 mL 正己烷振蕩，取其中上層正己烷溶液 12 mL 至 40 mL 玻璃瓶，加入 10 mL MeOH，慢慢滴加入 0.50 mL 乙酰氯，擰緊蓋子，85℃ 甲酯化 1 h，冷卻至室溫后加入 10 mL 水振蕩分層，取其上層正己烷 10 mL，氮吹至 1 mL 以下，定容至 1 mL。

1.5 色譜條件

色譜柱：毛細(xì)管柱 HP-5MS，30 m × 250 μm × 0.25 μm；進(jìn)樣口及檢測器溫度：270℃，進(jìn)樣量：1 μL，流動(dòng)相流速 1.0 mL·min-1；色譜柱溫度：40℃ 保持 5 min，10℃·min-1升至 170℃，6℃·min-1升至 224℃，60℃·min-1升至 300℃，保持 2 min；離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作曲線和檢出限

將配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在設(shè)定的 GC-MS 條件下進(jìn)行測試，其線性方程和相關(guān)系數(shù)見表 1。方法的檢出限和定量限依據(jù)線性最低濃度 0.2 μg·mL-1的 3 倍和 10 倍信噪比（S/N）計(jì)算[7]，見表 2，硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的檢出限分別為 9.5 × 10-3μg·mL-1和 6.0 × 10-3μg·mL-1。

Table 1 Liner and correlation coefficient表1 線性方程及相關(guān)系數(shù)

Table 2 Limit of detection and limit of quantitation表2 檢測限與定量限

2.2 專屬性

在確定的色譜條件下，分別對樣品和樣品加標(biāo)樣 A1 進(jìn)行色譜分析，利用保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量，圖 1、圖 2 和圖 3為以 74 為定量離子，空白，樣品，樣品加標(biāo)樣品的分離圖。硬脂酸甲酯、棕櫚酸甲酯的保留時(shí)間分別為 27.140 min、24.231 min。說明該方法對目標(biāo)物的專屬性。

Fig. 1 GC-MS SIM spectrum of blank 圖1 空白溶液的GC-MS SIM色譜圖

Fig. 2 GC-MS SIM spectrum of sample 圖2 樣品溶液的GC-MS SIM色譜圖

Fig. 3 GC-MS SIM spectrum sample spikes 圖3 樣品加標(biāo)溶液的GC-MS SIM色譜圖

2.3 重復(fù)性和中間精密度

6 個(gè)加標(biāo)量為 1.0 μg·mL-1的實(shí)測濃度見表 3，硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的 RSD 分別為 2.5%、5.1%，12 個(gè)加標(biāo)量為 1.0 μg·mL-1硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的 RSD 分別為 6.0%、9.0%，滿足《中國藥典》要求。

Table 3 Repeatability and precision表3 重復(fù)性與中間精密度

2.4 回收率

樣品中硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯測定值分別為 1.14 μg·mL-1和 0.40 μg·mL-1，按0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、1.5 μg/mL-1加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)濃度三個(gè)平行樣，測定結(jié)果見表 4。硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的回收率在 84.0%～112.7%，RSD 在 2.1%～5.9%。

Table 4 Recovery表4 加標(biāo)回收率

2.5 樣品測試

樣品中硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯測定值分別為 1.14 μg·mL-1和 0.40 μg·mL-1，則其相應(yīng)的硬脂酸和棕櫚酸的含量分別為 1.72 μg·瓶-1和 0.60 μg·瓶-1。

3 結(jié)論

本方法通過對門冬胰島素藥液與包材相容性測試，通過正己烷萃取藥液中微量的脂肪酸，再甲醇-乙酰氯甲酯化后富集，通過 GC-MS 測藥包材膠塞中兩種脂肪酸的遷移，通過線性、檢出限和定量限、專一性、重復(fù)性和中間精密度回收率幾個(gè)方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯的檢出限分別低至 6.0 μg·L-1、9.5 μg·L-1；其中間精密度和重復(fù)性在 10% 以內(nèi)；回收率 84.0%～112.7%。其中門冬胰島素干粉與包材中膠塞部件遷移至藥液中硬脂酸和棕櫚酸的含量分別為 1.72 μg·瓶-1和 0.60 μg·瓶-1。這幾個(gè)指標(biāo)均滿足藥典指標(biāo)，為后續(xù)的穩(wěn)定性提供方法。同時(shí)為水溶液中痕量的脂肪酸的測定提供參考方法。