原發(fā)性抗磷脂綜合征患者中性粒細(xì)胞關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析

林梅英，甘東輝，高穎，王正杰，陳志敏

(莆田學(xué)院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100)

原發(fā)性抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)是一種全身性自身免疫性疾病，特點(diǎn)是持續(xù)性的抗磷脂抗體陽性[1]。常見的臨床表現(xiàn)為廣泛的靜脈、動(dòng)脈或微血管血栓形成，非血栓性表現(xiàn)則包括瓣膜心臟病、肝纖維化、抗磷脂抗體相關(guān)腎病、血小板減少、溶血性貧血和認(rèn)知功能障礙[2]。中性粒細(xì)胞已被證明在誘導(dǎo)血栓形成中起作用，研究[3]表明，在自身免疫性疾病中，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)會(huì)導(dǎo)致靜脈和動(dòng)脈血栓栓塞，NETs 是由DNA、組蛋白和殺微菌蛋白組成的網(wǎng)絡(luò)，由激活的中性粒細(xì)胞通過一種名為NETosis的程序釋放出來。在APS中，抗磷脂抗體與中性粒細(xì)胞表面接觸，繞過正常的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞異常免疫效應(yīng)發(fā)生[4]。目前尚不清楚APS發(fā)生過程中中性粒細(xì)胞免疫異常具體的調(diào)控機(jī)制。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，現(xiàn)階段醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時(shí)代，測(cè)序技術(shù)和微陣列技術(shù)可以在基因水平對(duì)疾病獲得更深刻的認(rèn)識(shí)，通過生物信息學(xué)手段，挖掘大數(shù)據(jù)，研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種疾病[5]?，F(xiàn)擬通過生物信息學(xué)方法識(shí)別APS發(fā)病過程中中性粒細(xì)胞的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，從基因?qū)用鏋锳PS的機(jī)制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

在NCBI的綜合基因集數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)上以“antiphospholipid syndrome”“neutrophil”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，下載GSE102215[6]數(shù)據(jù)集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE102215)，該數(shù)據(jù)集基于GPL16791平臺(tái)[Illumina HiSeq 2500 (Homo sapiens)]，包含了9例APS患者的中性粒細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，9例健康人類中性粒細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2 DEGs篩選

使用R語言的limma包對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1(FC為差異倍數(shù))，矯正后P值(Padj)<0.05，獲得APS患者中性粒細(xì)胞中的DEGs。使用ggplot2包繪制差異基因火山圖，并標(biāo)記出上下調(diào)基因中差異倍數(shù)前5位的基因。

1.3 基因功能和通路富集分析

提取DEGs中上調(diào)(log2FC>0)和下調(diào)(log2FC<0)的基因，使用R語言的clusterProfiler包分別對(duì)兩群基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。使用ggplot2包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 上調(diào)和下調(diào)DEGs的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因篩選

分別將上調(diào)和下調(diào)的DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/)，構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protrin-protein interaction,PPI)，設(shè)置交互置信度為0.4，將所得網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件，使用cytohubba插件計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值權(quán)重分?jǐn)?shù)，對(duì)度值前30位的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行可視化，將網(wǎng)絡(luò)中度值前5位的基因鑒定為hub基因。

2 結(jié)果

2.1 APS中性粒細(xì)胞DEGs篩選

以|log2FC|>1,Padj<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在GSE102215數(shù)據(jù)集共篩選得到985個(gè)DEGs，其中上調(diào)DEGs 512個(gè)，下調(diào)DEGs 473個(gè)，圖1展示了這些基因的分布情況，上調(diào)基因中差異程度最大的5個(gè)基因?yàn)锳TOH8(log2FC=3.50)、LILRA4(log2FC=3.10)、SOWAHD(log2FC=3.85)、FAM3B(log2FC=2.80)、IFIT1(log2FC=2.74)。下調(diào)基因中差異程度最大的5個(gè)基因?yàn)镽ORA(log2FC=-2.58)、GRASP(log2FC=-2.55)、FAT4(log2FC=-2.48)、ZNF483(log2FC=-2.47)、GFPT2(log2FC=-2.42)。

FC差異倍數(shù)；Padj矯正后P值圖1 APS中性粒細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖

2.2 上下調(diào)DEGs的GO、KEGG富集分析

使用clusterProfiler進(jìn)行基因富集分析，上調(diào)基因主要富集到的GO條目包括固有免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、中性粒細(xì)胞激活、對(duì)TNF的反應(yīng)、對(duì)I型干擾素的反應(yīng)、I型干擾素信號(hào)通路、IL-1β產(chǎn)生、IL-8產(chǎn)生等，KEGG條目包括軍團(tuán)菌病、成骨細(xì)胞分化。下調(diào)基因主要富集到的GO條目包括T細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞分化和激活、TCR通路、T細(xì)胞選擇等，KEGG條目包括Th17細(xì)胞分化、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等。見圖2。

2.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因鑒定

將上調(diào)DEGs輸入STRING后得到了一個(gè)包括317個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 158條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape后計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值權(quán)重，度值越大表明該節(jié)點(diǎn)具有越廣泛的連接性，是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)。在上調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前5位基因?yàn)镮FIT1(13)、IFIT3(11)、CCL2(11)、TLR8(10)、IFI6(10)。下調(diào)DEGs輸入STRING后得到了一個(gè)包括360個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 498條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中度值前5位基因?yàn)镸YC(112)、CD8A(98)、FYN(80)、CD28(78)、LCK(76)(圖3，表1)。

A 上調(diào)DEGs GO和KEGG富集點(diǎn)圖；B 下調(diào)DEGs GO和KEGG富集點(diǎn)圖;BP 生物過程；CC 細(xì)胞組分；MF 分子功能；KEGG 京都基因與基因組百科全書;Padj矯正后P值 圖2 差異表達(dá)基因的基因富集分析

A 上調(diào)DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前30位基因互作網(wǎng)絡(luò)圖；B 下調(diào)DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前30位基因互作網(wǎng)絡(luò)圖圖3 APS中性粒細(xì)胞差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

表1 APS中性粒細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的前30個(gè)hub基因及其全稱

3 討論

原發(fā)性APS可以在沒有臨床和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)的患者身上發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病常伴隨其他疾病，主要包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和急性早幼粒細(xì)胞白血病，越來越多學(xué)者開始關(guān)注到APS患者中性粒細(xì)胞的異常反應(yīng)[7]。目前研究[8]認(rèn)為，APS的機(jī)制中最重要的就是抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies,aPL)的異常激活，aPL結(jié)合磷脂和各種細(xì)胞(血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞)表達(dá)的質(zhì)膜蛋白，產(chǎn)生高凝固性血液。盡管aPL具有已知的嗜血栓性作用，但這種疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

在上調(diào)基因構(gòu)成的核心PPI網(wǎng)絡(luò)中，包含了一群干擾素相關(guān)基因，包括IFIT1、IFIT3、IFI6、IFI35、IFI16、IFNAR1。IFIT1、IFIT3是干擾素依賴性多蛋白復(fù)合物的組成成分。研究[9]表明，I型干擾素基因在APS患者中的表達(dá)是通過漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞途徑、Toll樣受體(TLR7和TLR9)、抗β2糖蛋白I抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活和依賴于TLR4的NETs釋放，以及隨后的B細(xì)胞和漿母細(xì)胞激活而誘導(dǎo)的，并可通過TLR7和TLR9等Toll樣受體、抗β2糖蛋白I抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活和中性粒細(xì)胞外陷阱釋放，進(jìn)而激活B細(xì)胞和漿母細(xì)胞。在前瞻性研究中，干擾素評(píng)分高與預(yù)后差的相關(guān)性可以指導(dǎo)高危人群迅速治療[10]。CCL2是一種趨化因子，是參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程的分泌蛋白超家族，該趨化因子是 C-C趨化因子亞家族的成員，其特征在于兩個(gè)相鄰的半胱氨酸殘基。這種細(xì)胞因子對(duì)單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞顯示趨化活性[11]。TLR8是Toll 樣受體家族的成員，其在病原體識(shí)別和固有免疫激活中起重要作用,是非特異性免疫系統(tǒng)中抵御入侵病原體的第一道防線。此前有研究[12]表明，單核細(xì)胞中TLR8異常表達(dá)與aPL相關(guān)，但中性粒細(xì)胞中TLR8異常表達(dá)目前研究尚空白。此外，F(xiàn)ADD高表達(dá)也與APS相關(guān)，該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種銜接分子，可與各種細(xì)胞表面受體相互作用并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)。通過其 C 端死亡域，該蛋白可以被TNFRSF6/Fas受體、腫瘤壞死因子受體、TNFRSF25和TNFSF10/TRAIL受體募集，從而參與由這些受體引發(fā)的死亡信號(hào)，這提示細(xì)胞死亡在APS中的潛在調(diào)控作用[13]。下調(diào)基因主要參與的生物學(xué)功能和通路則與T細(xì)胞激活和分化密切相關(guān)，包括CD8A、IL7R、CD3E在內(nèi)的基因表達(dá)下調(diào)，這提示在APS中，通過中性粒細(xì)胞引起的多免疫細(xì)胞抑制反應(yīng)可能是一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上，本研究篩選到APS中性粒細(xì)胞中核心的上調(diào)基因：IFIT1、IFI35、IFI3、CCL2、TLR8、FCGR1A與核心的下調(diào)基因MYC、CD8A、FYN、CD28、LCK、GNB2L1可能與APS的中性粒細(xì)胞激活、NETs形成、免疫抑制等機(jī)制相關(guān)，本研究的局限性在于缺乏更多關(guān)于APS中性粒細(xì)胞的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)于篩選出來的核心基因仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步完善。