基于微流控技術的磁免疫熒光法在EB病毒檢測中的應用

李俊豪, 韓冠華, 林曉濤, 吳力強, 錢純亙, 徐軍發(fā)

(1.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院檢驗醫(yī)學研究所臨床免疫學教研室,廣東 東莞 523808;2.深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司,廣東 深圳 518100)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一種γ-皰疹病毒亞科的病毒。EBV感染與多種疾病有關,從急、慢性炎癥到惡性腫瘤,EBV都被認為參與了這些疾病的發(fā)病機制[1]。在EBV相關的惡性腫瘤中,鼻咽癌和胃癌是EBV相關死亡的最常見的原因[2-8]。由于患者的個體差異,單個抗體的檢測容易漏檢、誤檢。多個EBV抗體聯(lián)合檢測,可以為臨床提供更準確的診斷依據(jù)。例如:Epstein-Barr viral capsid antigen (EB VCA)IgA和EB病毒核心抗原1(EB NA1)IgA是最常用的鼻咽癌篩查標志物,EB VCA IgG、EB NA1 IgG的檢測結(jié)果有助于判斷患者是否屬于既往感染[9-11]。用ELISA的方法單獨檢測EB VCA IgA和EB NA1 IgA,特異性分別為83.8%和80.0%,而聯(lián)合檢測EB VCA IgA和EB NA1 IgA,特異性則高達90.6%。因此,EB VCA IgG、EB VCA IgA、EB NA1 IgG及EB NA1 IgA四者聯(lián)合檢測可以提高檢測的特異性及準確性,為臨床診斷決策提供更加全面且完整的檢測依據(jù)[12-16]。

目前臨床上檢測EBV抗體的方法主要為ELISA法和化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)法[17-19]。傳統(tǒng)的ELISA方法存在檢測時間較長,試劑用量大,自動化程度不高等缺點,而CLIA法也存在儀器過大,發(fā)光時間短,不適合在基層醫(yī)療機構推廣等缺點。近年來,在醫(yī)學科學與高新技術的碰撞下,具有檢測操作簡單化、報告結(jié)果即時化等優(yōu)點的即時檢驗(point of care testing,POCT)越來越受到人們的青睞。微流控技術(microfluidics)的優(yōu)點在于能夠?qū)α黧w體積及流速進行精確的控制。在檢測項目時,能夠保證高精度及靈敏度。同時還具有試劑及樣本消耗少,高通量,設備小型化及自動化等優(yōu)點。當新的傳染病暴發(fā)流行時,能夠快速、簡便地獲取檢測結(jié)果[20-23]。因此,微流控技術在POCT領域具有十分廣闊的應用前景[24-28]。Gao等[29]基于微流控技術建立了前列腺特異性抗原腫瘤標志物快速定量檢測方法,其線性范圍可以達到0.05～200 ng/mL。Ng等[30]也基于微流控技術建立了促甲狀腺激素和17β-雌二醇檢測的微流控芯片,每個項目在6 min內(nèi)即可出結(jié)果,而傳統(tǒng)的ELISA方法則至少需要60 min。

目前,市場上已有很多商業(yè)化的微流控芯片。其中,做免疫檢測微流控芯片較為成熟的廠家主要有瑞典Gyros公司及葡萄牙Biosurfit公司等。其中,Gyros公司設計的GyrosTM微流控免疫測定平臺主要用于藥代動力學及免疫原性分析[31],其芯片由于加工精度的要求,成本較高。Biosurfit公司利用了表面等離子共振原理設計的Spinit微流控平臺,在免疫檢測上主要用于C-反應蛋白的檢測[32]。其芯片結(jié)構相對復雜,芯片加工成本較高且儀器成本也較高。鑒于此,我們基于微流控技術及磁微粒免疫熒光分析技術專門設計出聯(lián)合檢測EB VCA IgG、EB VCA IgA、EB NA1 IgG及EB NA1 IgA的微流控芯片,在芯片設計上摒棄了很多造價高的設計,但不影響試劑在芯片內(nèi)的性能,可以降低并控制成本及芯片結(jié)構的穩(wěn)定性(批間差)。該芯片兼具小型化與自動化、檢測試劑消耗少、污染少、檢測快速等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

VLS3.50激光切割機(美國Universal Laser Systems公司);TBS-200微流控芯片真空熱壓機(浙江揚清芯片技術有限公司);Sorvall Legend Micro 21R高速微量離心機(美國Thermo公司);超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物公司);Epsilon 2-4 LSCplus真空冷凍干燥機(德國Martin Christ公司);渦旋振蕩器(美國Labnet公司);DCM8激光共聚焦顯微系統(tǒng)(德國Leica公司);微流控芯片檢測樣機、iFlash3000化學發(fā)光免疫分析儀(深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司)。

抗人IgA單克隆抗體(5 mg/mL)和抗人IgG單克隆抗體(5 mg/mL)購自美國Sigma-Aldrich公司;羧基磁珠(10 mg/mL)和羧基熒光微球(10 mg/mL)購自美國Thermo公司;EB VCA抗原(5 mg/mL)和EB NA1抗原(5 mg/mL)購自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA)(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);海藻糖、ProClin300、NaCl、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(分析純,美國Sigma-Aldrich公司);聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板材(成都世化亞克力科技有限公司);壓敏膠(美國3M公司)。2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2-(4-(2-羥乙基)哌嗪)乙磺酸(HEPES)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉(分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)粉末(10 mmol/L)購自北京利維寧生物科技有限公司；液氮購自深圳昌達利氣體服務中心。

1.2 微流控芯片制備方法

本芯片采用激光切割技術及真空熱壓相結(jié)合的加工工藝,具體步驟為:首先繪制芯片各層二維結(jié)構圖,如圖1。然后進行各層三維結(jié)構設計及優(yōu)化,最終得到如圖2a所示共5層的三維結(jié)構示意圖,分別為頂層、腔室存儲層、流體通道層、柔性閥門層、交互控制層。將平面結(jié)構圖導入VLS3.50 Universal激光切割機的配套軟件里,以PMMA板材為芯片材料,按照圖1所示,切割出如圖2a的5層結(jié)構,并按照圖2a順序貼好,放入微流控真空熱壓機下,在背壓0.5 MPa、正壓0.7 MPa,50 ℃的條件下熱壓5 min。即可得到如圖3a所示的微流控芯片。材料及貼膠要求見圖1注解,閥控結(jié)構見圖2c及2d。

圖3 芯片及凍干微球?qū)嵨飯DFig.3 Pictures of chip and lyophilized microspheres a.chip;b.lyophilized microspheres;c.detection pool with lyophilized microspheres.

1.3 微流控芯片試劑制備方法

1.3.1EB VCA、EB NA1抗原偶聯(lián)羧基磁珠方法

以制備2 mL 5 mg/mL的EB VCA抗原偶聯(lián)磁珠為例,EB NA1抗原偶聯(lián)磁珠同理。方法:首先移取0.5 mL(10 mg)的1 μm的羧基磁珠,用5 mL的MES (50 mmol/L,pH 6.0)緩沖液洗滌3次。然后加入活化試劑EDC和NHS各25 mg,在室溫下,將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上活化反應30 min。再將200 μL的EB VCA抗原加至5 mL的MES(50 mmol/L,pH 6.0)緩沖液中,配制成抗原液,將抗原液加到裝有活化磁珠的離心管內(nèi),在室溫下,將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上偶聯(lián)反應24 h。棄去上清液后再洗滌3次。最后一次洗滌后,重懸磁珠于2 mL洗滌緩沖液內(nèi),此時磁珠的質(zhì)量濃度約為5 mg/mL。

1.3.2抗人IgA、抗人IgG偶聯(lián)羧基熒光微球方法

以制備1 mL 0.5 mg/mL 抗人IgG偶聯(lián)的熒光微球為例,抗人IgA偶聯(lián)熒光微球的方法同理。方法:首先取10 mg羧基微球,加入1 mL MES(50 mmol/L,pH 6.0)緩沖液,在14 000 r/min的條件下離心10 min。棄去上清液,加入800 μL的MES(50 mmol/L,pH 6.0)緩沖液,進行超聲。然后稱取10 mg NHS和10 mg EDC分別溶于1 mL和2.5 mL的MES(50 mmol/L,pH 6.0)緩沖液中,振蕩混勻后,分別將100 μL NHS溶液和EDC溶液滴加到制備好的熒光微球溶液中,振蕩混勻。室溫下,避光旋轉(zhuǎn)混勻20 min。離心后棄去上清液。加入0.8 mL HEPES緩沖液(20 mmol/L,pH 7.4)到離心管中,超聲1 min。然后取100 μL 抗人IgG(5 mg/mL)抗體溶液加入到離心管中,振蕩混勻,室溫下避光旋轉(zhuǎn)混勻2 h。然后加入100 μL BSA溶液(20 mg/mL)封閉。室溫下,避光旋轉(zhuǎn)混勻1 h。離心后棄去上清液。加入1 mL PBS溶液(50 mmol/L,pH 7.4,含0.2%(質(zhì)量分數(shù))Tween 20+5%(質(zhì)量分數(shù))海藻糖),超聲后即可得到0.5 mg/mL鼠抗人IgG偶聯(lián)的熒光微球溶液1 mL。

1.3.3熒光微球及磁珠凍干方法

首先配制緩沖液,以1 L純水配制為例:向1 L純水中加入1.96 g PBS粉末、8.77 g NaCl、10 g BSA、10 g海藻糖、1 g ProClin300。用足量的緩沖液按照100∶1及10∶1的比例分別將偶聯(lián)好抗原的磁珠母液、偶聯(lián)好抗體的熒光微球母液稀釋成工作液。將1 L液氮倒入保溫盒中,再將酶標板放入保溫盒,盛滿液氮。用移液槍移取工作液20 μL,垂直在酶標板孔的上方點液,工作液會在液氮的條件下速凍成球型。再將凍干小球轉(zhuǎn)移到真空凍干機里,進行預凍、主干燥和終末干燥。將凍干后的小球放置在干燥環(huán)境下保存(見圖3b及3c)。

1.4 微流控芯片檢測儀器設計

儀器硬件及軟件由深圳亞輝龍生物科技股份有限公司(YHLO)相關專業(yè)人員設計,硬件主要有離心模塊、熒光顯微系統(tǒng)、磁吸控制模塊、自動化頂針模塊及芯片固定模塊等硬件。

1.5 微流控芯片反應原理及使用方法

采用磁免疫熒光法原理,形成磁珠-抗原-抗體-二抗-熒光微球復合物,見圖4a。操作的詳細方法見圖4b、4c、4d、4e及表1,簡述如下。

圖4 芯片檢測流程示意圖Fig.4 Schematic diagram of chip detection processa.first incubation step;b.second incubation step;c.cleaning step;d.detection step;for information on No.1-18,see Table 1.

表1 芯片檢測流程控制程序Table 1 Control procedure of chip detection process

第一步孵育:使用加樣槍在樣本腔的加樣孔點樣(樣本),操作儀器配套軟件,在給定的轉(zhuǎn)速、時間、閥門及磁鐵吸附狀態(tài)條件下,6 min內(nèi)自動完成第一步孵育。

第二步孵育:使用加樣槍在熒光微球池的液囊腔加樣孔加去離子水,在儀器控制下6 min內(nèi)自動完成第二步孵育。

清洗:使用加樣槍在清洗液池的液囊腔加樣孔加清洗液,在儀器控制下6 min內(nèi)自動完成清洗。

檢測:通過便攜式熒光顯微鏡獲取熒光微球的圖片,通過Image J圖像分析軟件將獲取的熒光圖片拆分成紅、綠、藍3個通道,用Image J對綠色通道圖進行熒光信號識別,得到平均熒光強度。

1.6 標準品配制、最佳臨界值確定方法

標準品配制方法:收集5例臨床上采用YHLO化學發(fā)光免疫分析儀(iFlash3000)測定為陽性的高值血清樣本,將這5例樣本混合后,用iFlash3000再次檢測3次,所檢出的濃度取平均值作為樣本的真實濃度。用樣本稀釋液將已知濃度的混合血清進行稀釋。分別配制成0、6.25、15、25、50、200 U/mL共6個濃度的系列參考標準品。標準品每瓶1 mL分裝,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

最佳臨界值確定方法:以臨床樣本的iFlash3000測試結(jié)果(陰陽性判斷)作為參考,對本方法測試結(jié)果的換算濃度使用OriginPro 2021軟件進行受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC curve)分析,確定本方法的最佳臨界值(optimal operating point,OOP)。

進行其他樣本測定時,高于最佳臨界值則定義為陽性,低于最佳臨界值則定義為陰性。

1.7 性能評價指標及統(tǒng)計學處理

劑量-反應曲線:以自制試劑標準品濃度為橫坐標(X),以平均熒光強度為縱坐標(Y),采用Graphpad Prism 9.0軟件擬合標準曲線方程,相關系數(shù)(R2)≥0.99,P<0.05表明線性良好。檢出限:平行測定20次零濃度標準品的平均熒光強度,計算平均值(AV)及標準差(SD),以均值AV+2SD的反應量代入標準曲線方程,所對應的濃度則為本方法的檢出限。

重復性:選取每個項目的高、低值質(zhì)控品重復測試10次,統(tǒng)計測試均值并計算相對標準偏差(RSD)。

特異性:本實驗室收集的巨細胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)抗體IgG、弓形蟲(Toxoplasma Gondii,Toxo)抗體IgG、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)抗體IgG、風疹病毒(Rubella virus,RV)抗體IgG、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)抗體IgG、EB VCA IgG、EB NA IgG、EB VCA IgA、EB NA IgA抗體陽性樣本,用本微流控芯片進行交叉反應檢測,分析芯片的特異性。

統(tǒng)計學處理:采用Graphpad Prism 9.0軟件擬合標準曲線方程,對微流控芯片法與CLIA法檢測結(jié)果的相關性進行驗證,R2≥0.95,表明相關性良好。采用SPSS 26.0軟件對微流控芯片法與CLIA方法檢測結(jié)果進行Kappa檢驗,若Kappa值在0.8～1之間,P<0.05,則可以認為兩種方法的檢測結(jié)果一致性較好。采用OriginPro 2021軟件制作Bland-Altman圖對微流控芯片法與CLIA方法臨床測試結(jié)果進行一致性分析,統(tǒng)計95%置信區(qū)間外的樣本數(shù)量占比。

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片通道結(jié)構表征

利用共聚焦顯微鏡對芯片進行掃描獲得芯片通道明場圖(見圖5a)和芯片通道三維結(jié)構圖(見圖5b),通過相關配套軟件可以獲得最大深度和通道橫截面積圖。深度圖可以直觀地反映出芯片通道加工好壞及最大縱深距離,而通道橫截面積則是計算單位時間內(nèi)流過通道的液體體積的重要參數(shù),最大深度及橫截面積數(shù)據(jù)見表2,各個通道的平均深度在90～100 μm之間,這是本研究所用的激光切割工藝在保證通道加工狀態(tài)良好的情況下能達到的最小深度范圍。

表2 各通道最大深度及通道橫截面積Table 2 Maximum depth and cross-sectional area of each channel

圖5 檢測區(qū)在共聚焦顯微鏡下的(a)明場及(b)三維示意圖Fig.5 (a)Bright field and (b)3D diagram of the detec-tion area observed using confocal microscope

2.2 最佳臨界值

各項目經(jīng)過ROC曲線測試,各項目ROC曲線見圖6,OOP、曲線下方面積(area under curve,AUC)、OOP對應的敏感度及特異性見表3。

表3 ROC曲線下最佳臨界點、靈敏度、特異性、曲線下方面積及參考樣本數(shù)Table 3 Optimal operating point (OOP),sensitivity,specificity,area under curve (AUC),and reference sample number under the ROC curve

圖6 EB VCA IgG、EB VCA IgA、EB NA1 IgG及EB NA1 IgA的ROC曲線(n=121)Fig.6 Receiver operating characteristic curves (ROC)of EB VCA IgG,EB VCA IgA,EB NA1 IgG and EB NA1 IgA (n=121)

2.3 檢測平臺的驗證

本研究設置了陽性、陰性及空白對照,使用10 μg磁珠量(50 μL抗原量)、10 μg熒光微球量(5 μL二抗量)、10 μL樣本量(樣本1∶20稀釋)的體系,20 min內(nèi)完成檢測,檢測結(jié)果分為明場和暗場圖片,如圖7所示。明場圖片下可以觀察到磁珠-抗原-抗體-二抗-熒光微球復合物的分散狀態(tài)良好,暗場圖片下則可以通過Image J軟件獲取平均熒光強度,再通過劑量-反應方程換算成濃度。陰性及空白樣本的濃度分別為2.25 U/mL及1.69 U/mL。均低于9.97 U/mL,為陰性。陽性樣本濃度為33.10 U/mL,高于9.97 U/mL,為陽性,符合預期。

2.4 性能驗證

各項目的劑量反應線性回歸方程R2、線性范圍和檢出限見表4,R2均大于0.99,P值均小于0.05。

重復性試驗結(jié)果如表5所示,4個項目的高低值樣本的RSD均小于10%,但后續(xù)仍需進一步驗證加速破壞條件下的精密度。

表4 各項目的劑量反應線性關系和檢出限Table4 LinearrelationshipofdoseresponseandLODofeachitemItemRegressionequationR2Linearrange/(U/mL)LOD/(U/mL)EBVCAIgGY=0.8532X+9.0440.99841.92-2001.92EBVCAIgAY=1.150X+9.3540.99582.79-2002.79EBNA1IgGY=1.127X+7.1720.99863.13-2003.13EBNA1IgAY=1.191X+14.770.99521.53-2001.53 Y:standardfluorescentsignalvalue;X:standardconcentration,U/mL;R2:correlationcoefficient.

表5 各項目重復性測試結(jié)果(n=10)Table 5 Repeatability test results of each item (n=10)

特異性測試結(jié)果顯示,除與自身相同項目的陽性血清樣本測試為陽性外,CMV、Toxo、MP、RV、VZV、EBV共6種病原體抗體陽性血清樣本,微流控芯片測試反應均為陰性,表明本芯片的特異性較好。但后續(xù)仍需進一步驗證芯片檢測的抗體與其他皰疹病毒如單純皰疹病毒1型及2型、卡波濟肉瘤相關病毒、人類皰疹病毒6型及7型等是否有交叉反應。

2.5 與CLIA法的方法學比對

將本檢測方法與CLIA檢測方法的結(jié)果進行相關性分析。分別收集71例(EB VCA IgG)、50例(EB VCA IgA)、71例(EB NA1 IgG)及50例(EB NA1 IgA)臨床上使用YHLO化學發(fā)光試劑盒驗證為陽性的樣本。同時收集50例(EB VCA IgG)、71例(EB VCA IgA)、50例(EB NA1 IgG)及71例(EB NA1 IgA)經(jīng)過YHLO化學發(fā)光檢測試劑盒測試為陰性的樣本作為陰性對照。用本研究所建立的微流控磁免疫檢測芯片進行檢測,以本方法測得的濃度值為橫坐標(X),以CLIA法測得的濃度值為縱坐標(Y),分析兩種方法檢測結(jié)果的相關性。EB VCA IgG、EB VCA IgA、EB NA1 IgG和EB NA1 IgA的線性回歸方程分別為Y=0.999 4X+0.096 09(R2=0.999 3)、Y=1.002X-0.028 18 (R2=0.997 9)、Y=1.002X+0.047 66 (R2=0.999 2)和Y=0.995 3X+0.070 87(R2=0.999 4),P均<0.000 1。各項目方法學比對的回歸方程R2均大于0.99,P值均小于0.05,說明相關性較好。

利用SPSS 26.0軟件對本檢測方法與CLIA檢測方法檢測結(jié)果進行kappa一致性分析,兩種方法陰陽性符合率均大于80%,各Kappa值均在0.8～1之間,各P值均小于0.05,可以認為兩種方法的檢測結(jié)果一致性較好,見表6。

表6 各項目方法學比對及Kappa值Table 6 Methodological comparison and Kappa valve of each item

利用Bland-Altman圖對臨床測試結(jié)果進行一致性分析,121例配對數(shù)據(jù)如圖8所示,95%置信區(qū)間外的樣本占比結(jié)果見表7。微流控芯片法與CLIA法測試結(jié)果相差的幅度在臨床上可以接受,可以認為兩種方法的測試結(jié)果具有較好的一致性。

圖8 各項目的Bland-Altman絕對偏差和相對偏差統(tǒng)計圖Fig.8 Bland-Altman statistical graphs of difference vs average and ratio vs average of each item

表7 各項目Bland-Altman圖的95%置信區(qū)間外的樣本占比Table 7 Sample proportion above the 95% confidence interval of Bland-Altman of each item

2.6 微流控試劑、儀器成本及優(yōu)勢分析

微流控試劑成本主要包括芯片原材料費用、壓敏膠費用、磁珠費用、熒光微球費用、抗原及抗體費用。目前微流控芯片的材料主要有硅制材料、高聚合材料、陶瓷等,其中硅制材料及陶瓷材料雖然具有良好的加工性能,但這些材料加工時間較長,不適合量產(chǎn)。高聚合物材料同時兼具加工性能良好、成本低、加工時間短、加工工藝簡單、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點[33-35]。故本實驗選取高聚合物材料中的PMMA為芯片加工材料。若將本芯片投入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時,則需考慮利用模塑法代替激光切割工藝,這能進一步縮短芯片的加工時間。儀器成本主要包括離心模塊費用、顯微拍照模塊費用、芯片固定模塊費用、配套軟件費用、頂針及磁吸模塊費用。詳見表8。

表8 微流控芯片、試劑及儀器成本價目表Table 8 Cost list of chips,reagents,and instruments

相對于傳統(tǒng)的ELISA方法,本方法的試劑成本及儀器成本比國內(nèi)ELISA試劑成本(約2元人民幣/測試)及儀器成本(約5 000元人民幣/臺)高一些,但具有檢測時間短、試劑消耗少、自動化程度高、污染少等優(yōu)點。相對于CLIA方法,本方法的試劑成本(含芯片)與CLIA相差不大(國內(nèi)CLIA試劑成本約10元人民幣/測試),但本方法的儀器成本明顯低于CLIA(國內(nèi)CLIA儀器成本約150 000元人民幣/臺)。同時還具有多項目聯(lián)合檢測、發(fā)光時間長、易于基層推廣等優(yōu)點。

3 結(jié)論

在本研究中,我們結(jié)合微流控技術及磁微粒免疫熒光分析技術建立的EB病毒標志物微流控檢測平臺經(jīng)過性能驗證及臨床樣本測試,檢測驗證與預期一致,臨床樣本檢測結(jié)果顯示與臨床使用的CLIA法的測試結(jié)果具有較好的一致性,同時本平臺還具有檢測時間短、試劑消耗少、污染少、自動化程度高、易于基層推廣等優(yōu)點,可適用于各級醫(yī)療機構。