大體積直接進(jìn)樣-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定水中7大類42種抗生素殘留

孫慧婧, 李佩紋, 張蓓蓓, 陳慧敏

(1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,國(guó)家環(huán)境保護(hù)地表水環(huán)境有機(jī)污染物監(jiān)測(cè)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210019;2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司,上海 200335)

隨著分析監(jiān)測(cè)技術(shù)的不斷提高,新型有機(jī)污染物已經(jīng)成為環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。藥品和個(gè)人護(hù)理品(PPCPs)、消毒副產(chǎn)物(DPBs)、全氟化合物(PFCs)等都屬于新型有機(jī)污染物?？股貙儆赑PCPs中的一種,被廣泛地用于人類和動(dòng)物的治療,目前在環(huán)境中被頻繁檢出,其種類包括磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類[1],檢出量一般在ng/L～μg/L級(jí)別[1-6]。目前尚無(wú)研究表明該水平的抗生素可對(duì)人體造成影響,但是環(huán)境中抗生素殘留可以誘導(dǎo)環(huán)境中耐藥基因的產(chǎn)生,使微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性[7]。目前我國(guó)僅在《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 8978-1996)和《發(fā)酵類制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 21903-2008)中規(guī)定了部分抗生素的單位產(chǎn)品基準(zhǔn)排水量限值,同時(shí)國(guó)務(wù)院頒布的《水污染防治行動(dòng)計(jì)劃》明確要求,制藥(抗生素、維生素)行業(yè)實(shí)施綠色酶法生產(chǎn)技術(shù)改造。多地也明確要求加強(qiáng)抗生素菌渣監(jiān)管,加強(qiáng)養(yǎng)殖投入品管理,依法依規(guī)限制使用抗生素等化學(xué)藥品。

現(xiàn)階段用于抗生素檢測(cè)的儀器方法包括:液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等[5,8-18],其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法專屬性強(qiáng),靈敏度高,更適用于環(huán)境中抗生素的痕量分析。水體中抗生素的前處理方法包括在線固相萃取法[8,10]、固相萃取法[9,11-13]、分散液液微萃取[17]、離子液體膜微萃取法[18],其中固相萃取是最常用于水中抗生素測(cè)定的方法。采用固相萃取法雖然可以達(dá)到富集濃縮目標(biāo)物的目的,但在前處理過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng),而且大部分抗生素屬于兩性化合物,理化性質(zhì)差異大,因此用該方法對(duì)水中抗生素進(jìn)行前處理時(shí)回收率變化范圍很大。例如:Gros等[19]采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了8類53種抗生素的定量分析方法,并對(duì)赫羅納河水進(jìn)行了檢測(cè),回收率為20%～160%;王蘊(yùn)馨等[20]建立了生活飲用水及水源水中3大類10種抗生素的全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)法,回收率為62.4%～119%。

應(yīng)對(duì)突發(fā)性應(yīng)急污染事件,往往樣品量需求大,分析時(shí)間緊迫,需要一種簡(jiǎn)單、快速、有效的前處理方法。本方法通過(guò)大體積進(jìn)樣提高化合物的靈敏度,前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、方便,具備高通量篩查及快速分析的優(yōu)點(diǎn)。目前采用大體積直接進(jìn)樣法對(duì)水中抗生素進(jìn)行前處理的報(bào)道不多,大體積直接進(jìn)樣法大多用于環(huán)境水體中農(nóng)藥的處理,進(jìn)樣體積為100 μL[21,22]?，F(xiàn)有研究中,朱峰等[23]建立了一種通過(guò)直接進(jìn)樣的方式對(duì)水體13種β-內(nèi)酰胺類藥物殘留進(jìn)行快速篩查的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;Bayen等[9]采用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法,以小體積直接進(jìn)樣方式分析了地表水和海水中8種特定的抗生素。

本研究采用大體積直接進(jìn)樣方式,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查和測(cè)定水體中7類42種抗生素的方法。與傳統(tǒng)前處理方法相比,本方法具有簡(jiǎn)單、快速、綠色、準(zhǔn)確度高、精密度高、消耗樣品量少的優(yōu)點(diǎn),為水中抗生素的殘留問(wèn)題提供了簡(jiǎn)單快速的解決方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(SCIEX Triple Quad 6500,美國(guó)Sciex公司);0.22 μm有機(jī)相濾膜(美國(guó)Waters公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q水(美國(guó)Bedford公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Merck公司);乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、甲酸、氨水(色譜純,德國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

42種抗生素包括(1)磺胺類(SAs):磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲噻二唑(SMTZ)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺二甲異嘧啶(SM2)、磺胺異惡唑(SIA)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMT)、磺胺間甲氧嘧(SMM)、磺胺氯吡嗪(SPZ)、磺胺惡喹啉(SQ);(2)林可酰胺類(LINs):克林霉素(CLIN)、林可霉素(LCM);(3)四環(huán)素類(TCs):土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環(huán)素(TC)、強(qiáng)力霉素(DOX)、米諾環(huán)素(MIC);(4)喹諾酮類(QNs):氧氟沙星(OFX)、諾氟沙星(NOR)、沙拉沙星(SAR)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM);(5)大環(huán)內(nèi)酯類(MLs):羅紅霉素(ROX)、克拉霉素(CLA)、泰樂(lè)菌素(TS)、螺旋霉素(SPM)、紅霉素(ERY)、阿奇霉素(AZI);(6)頭孢類(CEs):頭孢噻肟(CTX)、頭孢匹林(CP)、頭孢克洛(CEC)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢氨芐(CPX);(7)氯霉素類(CMs):氯霉素(CM)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FFC)。

7種內(nèi)標(biāo)包括:磺胺甲基嘧啶-D4(SMR-D4)、克林霉素-D3(CLIN-D3)、四環(huán)素-D6(TC-D6)、氧氟沙星-D3(OFX-D3)、羅紅霉素-D7(ROX-D7)、頭孢氨芐-D5(CPX-D5)、氯霉素-D5(CM-D5)

所有抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自百靈威科技有限公司,純度均大于98.0%。內(nèi)標(biāo)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,純度均大于98.0%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

量取100 mL純水,加入0.025 g Na2EDTA,再用甲酸或氨水調(diào)節(jié)pH值至6.0～8.0,配制成含有Na2EDTA的稀釋溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇(頭孢類用50%(v/v)乙腈水溶液)配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱保存。用甲醇配制1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用時(shí)用含Na2EDTA的稀釋溶劑配制成需要的質(zhì)量濃度。

7種內(nèi)標(biāo)分別用甲醇配制成100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液;用甲醇進(jìn)一步稀釋配制成SMR-D4、CLIN-D3和CM-D5質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL和TC-D6、OFX-D3、ROX-D7、CPX-D5質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL的內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 樣品前處理

量取100 mL水樣,經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾后,加入0.025 g Na2EDTA,再用甲酸或氨水調(diào)節(jié)pH值至6.0～8.0。取調(diào)節(jié)后的水樣1.0 mL,加入10 μL內(nèi)標(biāo)使用液后,混勻,直接進(jìn)樣。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Kinetex C18柱(50 mm×30 mm,2.6 μm,美國(guó)菲羅門公司);流動(dòng)相A:0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈;流速:0.4 mL/min;梯度洗脫程序:0～1.5 min,5%B;1.5～10.0 min,5%B～70%B;10.0～13.0 min,70%B～90%B;13.0～14.0 min,90%B;14.0～14.2 min,90%B～5%B;14.2～15.0 min,5%B。進(jìn)樣量:100 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離(ESI)源,離子源加熱溫度為500 ℃,檢測(cè)方式為智能化分時(shí)間段-多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)(Schedule-MRM)模式。柱切換:0～1.5 min,切換到廢液;1.5～15 min,切換到質(zhì)譜;正離子/負(fù)離子檢測(cè)。噴霧電壓為5 500 V/-4 500 V;霧化氣壓力為345 kPa (50 psi);輔助氣壓力為345 kPa (50 psi);氣簾氣壓力為207 kPa (30 psi)。各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI源和正、負(fù)離子掃描模式下,配制42種抗生素及其內(nèi)標(biāo)混合溶液(100 μg/L),采用流動(dòng)注射進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行掃描,確定最佳去簇電壓、碰撞能量及各化合物的母離子和子離子等質(zhì)譜參數(shù),優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

表1 42種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 42 antibiotics

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2.1.1質(zhì)譜離子源溫度的選擇

水樣經(jīng)過(guò)固相萃取富集濃縮后,一般用有機(jī)溶劑定容并進(jìn)樣分析,因此對(duì)離子源溫度要求不高(250 ～ 300 ℃),但由于本方法采用大體積水溶液直接進(jìn)樣,水溶液的霧化效率不如有機(jī)溶劑,因此質(zhì)譜離子源的霧化溫度對(duì)樣品離子化效率至關(guān)重要。本研究比較了250、400和500 ℃這3種不同離子源溫度下各目標(biāo)物的響應(yīng)情況(見圖1)。結(jié)果表明,在儀器推薦的溫度范圍內(nèi),隨著離子源溫度的升高,各類化合物的響應(yīng)也呈現(xiàn)明顯的增強(qiáng),這是由于大體積水溶液的進(jìn)樣需要更高的溫度才能使之更好地完成離子化。因此,實(shí)驗(yàn)選擇500 ℃作為離子源的溫度。

圖1 不同離子源溫度下各類抗生素的響應(yīng)值Fig.1 Responses of various antibiotics at different ion source temperatures

2.1.2采集模式的選擇

本方法還采用了智能化分時(shí)間段-多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)的采集模式,相比常規(guī)的多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)模式,該采集方式通過(guò)對(duì)一個(gè)分析測(cè)試周期的時(shí)間進(jìn)行合理分段,避免了常規(guī)的全分析周期全離子通道掃描,不同時(shí)間段僅掃描色譜出峰的離子通道,從而增加了每個(gè)目標(biāo)物離子通道的掃描時(shí)間,進(jìn)一步提高了各目標(biāo)物的響應(yīng),方法靈敏度提高2～4倍。圖2為42種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)的MRM色譜圖。

圖2 42種抗生素(0.5 μg/L)在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of the 42 antibiotics (0.5 μg/L)in positive and negative ion modes

2.2 Na2EDTA的添加對(duì)回收率的影響

四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素易與水中金屬形成穩(wěn)定的絡(luò)合物從而影響測(cè)定結(jié)果,因此本方法考察了實(shí)際水樣中Na2EDTA的加入對(duì)各類抗生素回收率的影響(見圖3)。研究發(fā)現(xiàn),未添加Na2EDTA時(shí),四環(huán)素類回收率僅為0%～15%,喹諾酮類回收率為35%～50%。添加Na2EDTA后,四環(huán)素類回收率顯著提高為94%～105%,但喹諾酮類回收率并未有提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)它們的質(zhì)譜響應(yīng)比未添加Na2EDTA時(shí)降低了近50～100倍,這是因?yàn)镹a2EDTA加入后水樣呈偏酸性(pH≈5)。因此添加Na2EDTA后需要對(duì)水樣pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)從而使喹諾酮類的質(zhì)譜響應(yīng)回升。

圖3 Na2EDTA的添加對(duì)抗生素回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of Na2EDTA addition on the recoveries of the antibiotics (n=3)

2.3 pH的優(yōu)化

頭孢類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)在酸、堿性條件下易發(fā)生水解;四環(huán)素類抗生素在堿性條件下會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化和降解反應(yīng);大環(huán)內(nèi)酯類在堿性條件下易發(fā)生開環(huán)反應(yīng),因此本方法考察了溶液在中性條件下實(shí)際水樣的回收率。對(duì)比了添加Na2EDTA，并將pH調(diào)節(jié)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0后6大類抗生素的回收率(見圖4)。結(jié)果可見,喹諾酮類的回收率得到了改善,且各大類抗生素的回收率為80.1%～125%,均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此本研究選擇水樣中加入Na2EDTA后并將水溶液pH值調(diào)節(jié)至6.0～8.0進(jìn)行測(cè)定分析。

圖4 pH值對(duì)抗生素回收率的影響(n=3)Fig.4 Effect of pH values on the recoveries of the antibiotics (n=3)

2.4 與固相萃取法的比較

分別考察了采用大體積直接進(jìn)樣法和固相萃取法時(shí)水體中抗生素的回收率。不同種類的抗生素由于具有不同的酸堿性,其pKa值為2.1～9.0,因此前處理時(shí)需要調(diào)節(jié)不同的pH值使之更好地被固相萃取小柱吸附萃取。根據(jù)文獻(xiàn)[24,25]及以往的經(jīng)驗(yàn),Oasis HLB柱和MCX柱適用于分析不同種類的抗生素。因此將本方法與采用Oasis HLB柱和MCX柱的固相萃取法的回收率進(jìn)行比較,具體流程見圖5。結(jié)果如圖6所示,大體積直接進(jìn)樣法對(duì)大多數(shù)抗生素的回收率優(yōu)于固相萃取法。本方法沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前處理過(guò)程,目標(biāo)化合物損失少,更適合于水體中化學(xué)性質(zhì)各異的抗生素的檢測(cè)。

圖5 3種前處理方法的流程圖Fig.5 Flow diagrams of three pretreatments

圖6 采用大體積直接進(jìn)樣法與固相萃取法時(shí)42種抗生素回收率的比較Fig.6 Comparison of recoveries of the 42 antibiotics using large volume direct injection method and SPE method LVI represents the recoveries of the antibiotics using large volume direct injection method;HLB,MCX represent the recoveries of the antibiotics using SPE method.

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍與方法檢出限

配制每種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按確定的分析條件進(jìn)行測(cè)定,以各物質(zhì)的質(zhì)量濃度(ng/L)為橫坐標(biāo)X,以其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,42種抗生素在各自的線性范圍內(nèi)線性良好(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)。

根據(jù)HJ 168-2020方法檢出限測(cè)定要求,將42種低濃度抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至超純水中,按照樣品分析過(guò)程平行測(cè)定7份。結(jié)果表明,42種抗生素的方法檢出限為0.015 ～ 3.561 ng/L(見附表1)。方法靈敏度高,完全能夠滿足環(huán)境水體中該抗生素檢測(cè)要求。

2.5.2準(zhǔn)確度與精密度

分別于空白純水和地表水中加入質(zhì)量濃度范圍在50～500 ng/L之間的低、高兩種水平的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液,每個(gè)水平各平行測(cè)定3次,考察其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,方法的回收率為80.1%～125%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～12.2%(見附表2)。

2.6 與其他方法比較

2.6.1檢出限

抗生素在環(huán)境水體中一般為痕量水平,且大體積直接進(jìn)樣法未有濃縮富集的步驟,化合物的質(zhì)譜響應(yīng)是通過(guò)提高進(jìn)樣量和優(yōu)化質(zhì)譜條件來(lái)提高的,因此靈敏度的高低是該方法能否直接應(yīng)用于環(huán)境水體中抗生素殘留檢測(cè)的關(guān)鍵。本研究將大體積直接進(jìn)樣法的方法檢出限與現(xiàn)有的抗生素標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道中的方法檢出限進(jìn)行比較(見表2),表明本方法可以滿足標(biāo)準(zhǔn)方法的要求,大多數(shù)化合物的方法檢出限低于文獻(xiàn)報(bào)道,說(shuō)明直接進(jìn)樣法的靈敏度高,符合痕量檢測(cè)的需求。

表2 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法及其他文獻(xiàn)方法檢出限的比較Table 2 Comparison of method detection limits (MDLs)of this study with standards and other literatures

2.6.2回收率

將本方法的回收率與文獻(xiàn)報(bào)道的固相萃取法的回收率進(jìn)行比較。如表3所示,經(jīng)過(guò)固相萃取的抗生素回收率差異較大,這是由于每種抗生素的理化性質(zhì)差異大,固相萃取法難以涵蓋全面,大體積直接進(jìn)樣法可以彌補(bǔ)固相萃取法的不足,兼顧各類抗生素的回收率。大體積直接進(jìn)樣法消耗的樣品量少和有機(jī)溶劑少,更加綠色環(huán)保;無(wú)需前處理設(shè)備、玻璃器皿的重復(fù)使用減少了殘留的可能性;前處理過(guò)程大大縮短可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè),因此該方法適用于高通量的樣品測(cè)定與快速分析。

2.7 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對(duì)長(zhǎng)江流域的10個(gè)點(diǎn)位的水源地水及江蘇省某市的5個(gè)點(diǎn)位的末梢水開展42種抗生素監(jiān)測(cè),共檢出了12種抗生素,總含量范圍為ND～80.3 ng/L(見表4)?；前奉?、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素類普遍檢出,在水源地水中這4大類的檢出率為100%;12種檢出的抗生素中含量最高的為氟苯尼考,范圍為24.8～33.6 ng/L,其次是林可霉素,范圍為3.83～13.8 ng/L,其余種類的抗生素在所有點(diǎn)位均未被檢出。

3 結(jié)論

建立了大體積進(jìn)樣直接檢測(cè)環(huán)境水體中7大類42種抗生素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,與固相萃取方法相比大大節(jié)省方法開發(fā)的時(shí)間,提高工作效率,具有簡(jiǎn)單、快速、精密度高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、樣品消耗量小的優(yōu)點(diǎn),為地表水、地下水、末梢水等較為潔凈的水體中抗生素的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單、快速、可靠的解決方案,同時(shí)也為高通量的快速篩查提供了優(yōu)勢(shì)。