基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接探討“乳香-沒藥”治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機制

雷經(jīng)緯，周小海，盧 敏，胡志希*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是近年來老年患者致殘的主要原因之一，其特征是關(guān)節(jié)軟骨退化，關(guān)節(jié)滑膜并伴有不同程度的炎癥，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、疼痛甚至喪失功能活動[1-2]。口服非甾體抗炎藥物是目前治療本病最常見的非手術(shù)療法，但由于其療效有限且存在諸多不良反應，患者不可長期用藥[3]。因此，從尋找可靠、有效的中藥治療KOA成為目前的一大研究熱點。

KOA屬于中醫(yī)“膝痹”“骨痹”等范疇，擅于活血消腫止痛之經(jīng)典藥對沒藥、乳香，出自經(jīng)典醫(yī)籍《證治準繩》中收錄的“乳香止痛散”，是治療KOA運用頻率最高的處方[4]。乳香性偏溫，長于行氣活血舒筋，沒藥性偏平，長于活血散瘀[5]。但中藥成分復雜，目前的研究尚缺乏有效方法來客觀評價中藥多成分的作用機制。網(wǎng)絡藥理學是一種新的研究方式，可結(jié)合系統(tǒng)生物學和生物信息學，通過網(wǎng)絡分析探索藥物活性的潛在機制[6]?；诖耍疚睦镁W(wǎng)絡藥理學及分子對接探索乳香、沒藥的潛在有效物質(zhì)，并對治療KOA靶點及分子機制進行預測研究，以期為進一步的相關(guān)實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 “乳香-沒藥”活性成分及其靶點的篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得“乳香-沒藥”的有效成分，設(shè)定類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18及口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30進行篩選[7]，獲得藥物活性成分及作用靶點，隨后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點進行矯正和轉(zhuǎn)換為靶點基因，限定物種為“人類”[8]，即為“乳香-沒藥”主要活性成分的預測靶點。

1.2 KOA疾病相關(guān)靶點篩選

以“Knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM兩大常用疾病數(shù)據(jù)庫進行檢索，篩選出KOA相關(guān)的疾病靶點，去除重復內(nèi)容后，同樣借助Uniprot數(shù)據(jù)庫對疾病靶點進行基因轉(zhuǎn)換。然后借助R語言相關(guān)程序?qū)ⅰ?.2”項中獲得的藥物靶點與KOA疾病相關(guān)靶點取交集提取交集靶基因，繪制韋恩圖。

1.3 “藥物-成分-疾病-靶標”調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.0軟件將“1.3”項中獲得的交集靶基因與藥物、疾病相映射，即“藥物-成分-疾病-靶標”網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡圖中藥物成分、疾病以及兩者交集靶標分別以不同形狀的節(jié)點代表，藥物活性成分的“degree”值通過使用 “CentiScape”插件分析得出，其值大小用以評估判斷活性成分是否發(fā)揮主要功能。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將交集靶基因?qū)氲絊TRING平臺設(shè)置最小互作分數(shù)值為0.9(最高置信度)，獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，隨后將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.0軟件中用以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，根據(jù)“degree”值大小進行排序，其值越大，成為化合物的關(guān)鍵作用靶點可能性越大。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將交集靶標利用R語言軟件運行，得到基因本體論(Gene Ontology，GO)及基因通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。將得到的KEGG通路分析結(jié)果導入Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化展示。

1.6 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接認證

分子對接是基于Scripps研究所發(fā)與維護AutoDock 4.2軟件進行的，通過上述“1.4”項下步驟篩選出富集交集靶點最多的有效活性成分，將其作為配體，其三維結(jié)構(gòu)通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜集。步驟“1.5”項中“degree”值最大的蛋白為受體，其蛋白結(jié)構(gòu)通過PDB數(shù)據(jù)庫搜集，將搜集到的蛋白結(jié)構(gòu)導入OpenBabel 2.4.1軟件中進行格式轉(zhuǎn)換等操作后，利用AutoDock 4.2軟件行分子對接[9]。

1.7 觀察項目

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法對“乳香-沒藥”藥對治療KOA的機制靶點進行預測，選取的觀察指標主要包括藥對的關(guān)鍵有效活性成分、蛋白互作網(wǎng)絡的核心靶蛋白、GO及KEGG通路富集分析結(jié)果以及藥對核心有效化合物與靶蛋白的對接活性。

2 結(jié)果

2.1 “乳香-沒藥”有效成分及其靶點篩選結(jié)果

經(jīng)先前設(shè)定的條件進行篩選，藥對中共有40個有效成分最終納入，其中乳香32個，沒藥8個。對這40個有效成分進行靶點預測，去重后共獲得靶點基因162個。見表1。

表1 “乳香-沒藥”藥對活性成分列表

2.2 KOA疾病靶點的篩選結(jié)果

檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲取共1 646個KOA相關(guān)的疾病基因，通過使用Uniprot數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)對疾病靶點進行人類基因名注釋轉(zhuǎn)換。利用R語言程序提取KOA相關(guān)靶基因與藥對中有效成分的交集靶點83個，并繪制維恩圖，見圖1。

圖1 “乳香-沒藥”藥對與疾病靶點的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-疾病-靶標”調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建結(jié)果

將83個“乳香-沒藥”藥對治療KOA的交集靶基因分別與3個乳香，17個沒藥活性成分進行映射，建立它們之間的對應關(guān)系，將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1軟件中繪制“藥物-成分-疾病-靶標”調(diào)控網(wǎng)絡圖(圖2)。借助CentiScape插件，分析出不同節(jié)點的degree值，其值越大意味著該節(jié)點在網(wǎng)絡中發(fā)揮越重要的作用。通過計算結(jié)果可知：沒藥中排名前3的有效成分分別為槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol β)、豆甾醇(Stigmasterol)，對應的degree值分別為77、14、6。乳香中排名前三的是乳香脂酸(Boswellic acid)、扁枝杉烯(phyllocladene)、3-氧代-酪氨酸(3-oxo-tirucallic acid)，對應的degree值分別為2、2、2。

注：菱形節(jié)點代表“乳香-沒藥”藥對，六邊形節(jié)點代表KOA疾病，三角形節(jié)點分別代表乳香、沒藥有效成分，圓形節(jié)點代表交集靶標，連線代表靶點之間的聯(lián)系。

圖2 “乳香-沒藥”治療KOA的“藥物-成分-疾病-靶標”網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及分析結(jié)果

篩選得到的83個疾病與藥物交集靶標導入STRING平臺，限定物種為人類，設(shè)置最小互作分數(shù)值為0.9(最高置信度)進行蛋白網(wǎng)絡互作分析，分析結(jié)果導入Cytoscape軟件中繪制PPI網(wǎng)絡圖，如圖3所示。網(wǎng)絡中共有83個節(jié)點，相互間的連線代表存在相互作用。節(jié)點的大小和顏色深淺隨degree值大小變化，即靶基因的degree值越大，則對應的節(jié)點越大和顏色越濃。排名前五的為：白細胞介素-6(IL-6)、Jun激酶(JNK)、白細胞介素-1B (IL-1B)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)，degree值分別為：28、23、21、17、16，表明其在網(wǎng)絡中處于核心地位。

注：圖中節(jié)點表示PPI網(wǎng)絡中的靶蛋白，節(jié)點的面積越大且顏色越深則該蛋白的“degree”值越大，在網(wǎng)絡中的地位越重要。

2.5 基因功能與通路分析

本次研究GO分析劃分為生物過程(BP)、細胞組分(CC)以及分子功能(MF)3類，對排名前5的GO富集分析進行展示。BP分析結(jié)果主要集中于脂多糖反應、氧化應激反應、活性氧的反應、細菌來源分子反應等生物過程，見表2。CC分析結(jié)果主要集中于膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復合物、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等細胞組分，見表3。MF分析結(jié)果主要集中于細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能。見表4。

表2 “乳香-沒藥”藥對治療KOA潛在靶點的GO富集分析(BP)

表3 “乳香-沒藥”藥對治療KOA潛在靶點的GO富集分析(CC)

表4 “乳香-沒藥”藥對治療KOA潛在靶點的GO富集分析(MF)

KEGG通路分析結(jié)果顯示，見圖4?！叭橄?沒藥”干預KOA主要涉及糖尿病并發(fā)癥信號通路、黏液剪切應激及動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等信號通路。以上結(jié)果提示“乳香-沒藥”包含的主要活性成分其作用靶點在不同的代謝通路分布廣泛，其干預KOA可能是通過多成分、多靶點相互調(diào)節(jié)的。

圖4 “乳香-沒藥”藥對主要活性成分干預KOA的靶基因-信號通路網(wǎng)絡

2.6 分子對接分析結(jié)果

基于以上結(jié)果分析，活性成分槲皮素涉及的疾病靶點最多，PPI網(wǎng)絡中分析得出“degree”值排名最前的靶點為IL-6，因此，分別選擇Quercetin和IL-6作為配體和受體用于本次分子對接。通過在PubChem上檢索，得到到槲皮素三維結(jié)構(gòu)及其CID：5280343，圖5A。通過在PDB上檢索，得到IL-6蛋白ID為4NI7并下載其結(jié)構(gòu)，剔除所有配體及水分子(圖5B)。經(jīng)Autodock軟件進行分子對接，結(jié)果顯示槲皮素(quercetin)被“埋在了”受體IL-6蛋白結(jié)構(gòu)4NI7的活性口袋中，這樣的結(jié)構(gòu)大大增加了兩者結(jié)合的可能性，圖5C。通過PYMOL軟件顯示槲皮素與受體IL-6相對應的氨基酸殘基分別是第93、97位：氨基酸GLU-93(谷氨酸-93)、TYR-97(酪氨酸-97)、而槲皮素與IL-6之間最短距離為2A，圖5D。

注：圖5A所示為槲皮素的化合物分子結(jié)構(gòu)；圖5B為IL-6的蛋白飄帶模型；圖5C為槲皮素被包裹在IL-6靶蛋白的活性口袋中；圖5D所示化合物槲皮素與受體IL-6的氨基酸(GLU-93、TYR97)殘基，虛線表示兩者之間的氫鍵。

3 討論

3.1 “乳香-沒藥”的配伍應用具有現(xiàn)代科學依據(jù)

乳香、沒藥配伍成方應用多見于傷科疾病中，目前現(xiàn)代藥理學已被證實的主要成分為揮發(fā)油類，包括單萜、倍半萜、烯醇和酯類等成分[10-11]。乳香、沒藥所含活性成分較多，其干預KOA靶點及機制尚不完全明確。通過TCMSP數(shù)據(jù)量基于ADME標準對藥對的活性成分進行篩選，得出在沒藥的活性成分中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇干預KOA靶標的基因富集性較高、即成發(fā)揮關(guān)鍵作用概率最大。槲皮素通過體內(nèi)代謝生成的代謝產(chǎn)物所具有的強氧化作用是其發(fā)揮抗炎活性的關(guān)鍵[12]。β-谷甾醇可明顯刺激成骨細胞OPGm RNA表達，不僅直接促進成骨作用，而且通過有效地抑制破骨作用達到護骨效果[13]。有報道稱，豆甾醇可作為治療KOA的一個可能的治療劑，其能通過阻礙制促炎性介質(zhì)(TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS和COX-2)并通過下調(diào)關(guān)節(jié)中NF-κBp65(抑制p-IκB-α激活)和p38MAPK的表達來增加抗炎細胞因子(IL-10)的表達，從而減少軟骨退化[14]。在乳香的活性成分中，乳香脂酸能抑制促炎細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ)的釋放，減輕膝關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬，改善其活動度[10，15]。“乳香-沒藥”配伍干預的KOA的活性成分多且復雜，且兩者的活性成分均對KOA的炎癥效應均具有抑制作用，從一定程度上印證二者配伍應用的科學性。

3.2 “乳香-沒藥”干預KOA的靶點與炎性靶蛋白關(guān)系密切

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖中得到“乳香-沒藥”干預KOA的核心靶基因，其中IL-6、JUN、IL1β的度值較高，是“乳香-沒藥”干預KOA的主要作用靶點。IL-6生物活性復雜多樣，能夠作用于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展病理過程中諸多環(huán)節(jié)，如促使淋巴細胞分泌相關(guān)免疫球蛋白，加重關(guān)節(jié)的炎癥程度等最終導致關(guān)節(jié)軟骨的破壞增強，使病變進一步發(fā)展，部分研究表明KOA患者關(guān)節(jié)損傷程度與血清中IL-6因子水平顯著相關(guān)[16]。IL-1β屬于經(jīng)典的IL-1家族，為KOA進展過程中涉及的重要促炎細胞因子，在OA的炎癥反應過程中不可忽視，IL-1可提高軟骨、滑膜等關(guān)節(jié)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，刺激膠原酶和中性蛋白酶等在滑膜細胞中合成，進而滑膜周圍發(fā)生炎性病變[17-18]。JUN是AP-1家族主要成員之一，其亞類c-Jun是KOA發(fā)病的重要基因，已有研究指出一定程度的應激刺激可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號蛋白通路加速軟骨細胞外基質(zhì)降解，引起關(guān)節(jié)軟骨退變，從而加速KOA的進展[19-20]?！叭橄?沒藥”干預KOA的靶點與炎性靶蛋白關(guān)系密切，這可能與其無菌性炎癥反應的發(fā)病機制不謀而合，本研究預測的相關(guān)炎性靶點可為進一步實驗驗證提供指導。

3.3 “乳香-沒藥”干預KOA的生物學過程具有多組分、多途徑的特點

從GO富集分析結(jié)果表明，“乳香-沒藥”治療KOA生物過程主要涉及脂多糖反應、氧化應激反應等，細胞組分主要涉及細胞膜相關(guān)結(jié)構(gòu)上，分子功能主要涉及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、核受體活性等參與，以上諸多生物學過程和功能在乳香、沒藥活性成分調(diào)節(jié)對應靶基因和通路過程中均有體現(xiàn)。脂多糖可誘導生成一氧化氮(NO)，NO是KOA重要的炎癥介質(zhì)，其可誘導線粒體損傷和胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活化，引發(fā)核內(nèi)染色體降解及凝結(jié)，凋亡小體形成，從而軟骨細胞凋亡被誘導，加重了軟骨損傷的進展[21-22]，“乳香-沒藥”藥對可能通過阻斷這一惡性過程來干預KOA。大量的KOA相關(guān)的信號通路受體聚集在細胞膜上，如TGF-β信號通路中主要通過在細胞膜上形成Ⅰ型受體和Ⅱ型受體的復合體來啟動信號的發(fā)生[23]。抑制細胞因子介導的信號通路是分子治療KOA的重要方式，其包括細胞因子中和、受體阻滯、細胞因子過程抑制、細胞因子合成、反應抑制以及聯(lián)合的治療[24]。

3.4 “乳香-沒藥”干預KOA的涉及炎癥、代謝以及腫瘤多種信號通路

從信號通路來看，“乳香-沒藥”治療KOA主要涉及代謝、炎癥、感染以及腫瘤等相關(guān)信號通路。其中AGE-RAGE排名最靠前，對于晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)信號傳導途徑的深入研究，使人們認識到AGEs可以誘導人OA滑膜細胞COX-2的表達和前列腺素E2(PGE2)、IL-6和MMP-13的產(chǎn)生，另外AGEs受體中和抗體(RAGE)能有效逆轉(zhuǎn)人滑膜細胞的炎癥反應和VEGF生成，提示RAGE在滑膜細胞活化中起重要作用，從而促進OA的進展[25-26]。IL-17信號通路關(guān)鍵蛋白(IL-17RA、IL-17RC、ACT1、TRAF6和RELA)過度表達和活化，在關(guān)節(jié)軟骨炎癥具有重要作用。 IL-17還能與炎癥因子發(fā)揮協(xié)同作用，放大加強如TNF-α等的致炎效應[27-28]。TNF在體內(nèi)介導了廣泛的細胞反應，TNF-α可以激活JNK和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等信號通路，JNK信號通路參與軟骨細胞凋亡過程，并可抑制Sox-9的表達，通過阻斷NO降低軟骨細胞的凋亡水平[29]。NF-κB信號通路被激活，可快速誘導IL-1β、TNF-α、IL-17等相關(guān)炎癥因子釋放加速炎癥反應發(fā)生[30]。同時，在分子對接結(jié)果中，槲皮素與IL-6蛋白之間對接匹配度較適宜，同時它們之間形成的氫鍵數(shù)目較多且距離較短，這說明槲皮素干預KOA作用機制很可能與此氨基酸的殘基相關(guān)，槲皮素與IL-6關(guān)鍵靶蛋白間的對接具有一定的適配性，從分子角度剖析本研究預測結(jié)果的準確性。

3.5 本研究的不足與展望

本研究仍存在一些局限性。首先，藥物活性成分的獲取基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫和文獻，而非液相色譜、質(zhì)譜或其他實驗方法來獲取。其次，本研究中篩選后的乳香有效成分較少，在匹配靶基因過程中沒藥有效成分占大部分比例，這與兩者配伍用于臨床的干預KOA的過程的實際情況可能存在偏倚。同時，本次研究分析得到的部分關(guān)鍵目標和路徑尚缺乏實驗研究驗證，可為今后相關(guān)研究提供新的思路。