玄參配方顆粒含量測(cè)定和特征圖譜測(cè)定方法研究

楊曉彬，黃 勇，陳丹純，江澤鴻

(康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300)

中藥材玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)為玄參科草本植物的干燥根，有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效。主要用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽等[1]。

玄參多糖含量較高，容易發(fā)生吸潮、霉變和生蟲現(xiàn)象，不易儲(chǔ)存[2]。玄參配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的玄參飲片為原料，經(jīng)過(guò)現(xiàn)代工藝加工制成的一種統(tǒng)一規(guī)格、統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的新型配方用藥，該藥既可保證原中藥飲片的特征，能滿足醫(yī)師進(jìn)行辨證論治，隨癥加減，同時(shí)又具有不需要煎煮、直接沖服、服用量少、安全衛(wèi)生、攜帶保存方便、易于調(diào)制和適合工業(yè)化生產(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)[3]。玄參已經(jīng)分離出的化學(xué)成分有50多種，主要是環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、有機(jī)酸及揮發(fā)油等，環(huán)烯醚萜苷中哈巴俄苷和哈巴苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠甲單孢菌均具有抗菌活性[4]。

本研究采用超高效液相色譜法對(duì)玄參配方顆粒的哈巴俄苷和哈巴苷的含量測(cè)定方法和特征圖譜測(cè)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)，為玄參配方顆粒替代傳統(tǒng)藥材的可行性研究和臨床研究提供可行性依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀(二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司)；OpenLAB CDS工作站(美國(guó)安捷倫公司)；ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國(guó)Waters)；ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國(guó)Waters)；梅特勒-托利多XS205DU電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多)；超聲機(jī)(KQ-700VDB，昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇(KRUDE，880502)、乙腈(KRUDE，880601)、磷酸(CNW，8620060)均為色譜純，水為超純水。

哈巴苷對(duì)照品(批號(hào)111729-201707，96.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；哈巴俄苷(批號(hào)111730-201709，95.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；桃葉珊瑚苷(批號(hào)111761-201707，100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201713，92.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；玄參對(duì)照藥材(批號(hào)121008-201609，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

玄參配方顆粒(6批配方顆粒成品批號(hào)：1708014、1708015、1708016、2004016、2004017、2004018，康美藥業(yè)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈巴苷與哈巴俄苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取取哈巴苷對(duì)照品、哈巴俄苷對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每 1 mL 含哈巴苷60 μg、哈巴俄苷20 μg 的混合溶液，即得玄參配方顆粒對(duì)照品混合溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取玄參配方顆粒，研細(xì)，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率 350 W，頻率 45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得玄參配方顆粒供試品溶液。

2.1.3 色譜分析條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；以乙腈為流動(dòng)相 A，以0.03%磷酸溶液為流動(dòng)相 B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘0.425 mL；測(cè)波長(zhǎng)為210 nm(前7.5 min)，后變換為280 nm。理論板數(shù)按哈巴俄苷和哈巴苷計(jì)算均應(yīng)不低于5 000。

表1 梯度洗脫

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、配方顆粒供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，樣品中各個(gè)峰分離較好，峰型對(duì)稱，且陰性無(wú)干擾，表明該法專屬性良好。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 陰性樣品溶液色譜

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得哈巴苷和哈巴俄苷的峰面積RSD均為0.2%，保留時(shí)間RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取取哈巴苷對(duì)照品、哈巴俄苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成哈巴苷系列對(duì)照品溶液(15 μg/mL，30 μg/mL，60 μg/mL，90 μg/mL，120 μg/mL)、哈巴俄苷系列對(duì)照品溶液(5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL)，分別吸取2μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果顯示哈巴苷回歸方程：y=1.698x+0.625 34(r=0.999 937)，表明哈巴苷在15～120 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；哈巴俄苷回歸方程：y=11.39701x+0.99622(r=0.999 949)，表明哈巴俄苷在5～40 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玄參配方顆粒，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取2 μL進(jìn)樣，測(cè)得哈巴苷和哈巴俄苷的含量平均值分別為2.325 mg/g和0.703 mg/g，RSD分別為0.8%和0.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品各0.5 g，精密稱量6份，分別添加一定量的哈巴苷、哈巴俄苷對(duì)照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取2 μL進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。哈巴苷、哈巴俄苷的平均回收率在95%～102%之間，且RSD均小于2%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 哈巴苷、哈巴俄苷回收率

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一批玄參配方顆粒，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取2 μL進(jìn)樣，以哈巴苷、哈巴俄苷峰面積為參照，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間和哈巴苷、哈巴俄苷。結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間和哈巴苷、哈巴俄苷含量無(wú)明顯變化，RSD<2%，表明在48 h內(nèi)供試品供試液穩(wěn)定。

2.3 含量測(cè)定結(jié)果

按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測(cè)定哈巴苷、哈巴俄苷的總量，結(jié)果如表3。結(jié)果表明，6批玄參配方顆粒哈巴苷、哈巴俄苷的總量均大于3 mg/g。

表3 玄參配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 玄參配方顆粒特征圖譜分析

3.1 參照物溶液的制備

取玄參對(duì)照藥材 0.3 g，置具塞錐形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含桃葉珊瑚苷20 μg、哈巴苷50 μg、毛蕊花糖苷20 μg、哈巴俄苷20 μg 的溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取0.2 g至具塞錐形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ACQUITY UPLC? HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國(guó)Waters)；以乙腈為流動(dòng)相 A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相 B，按表4中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，流速為每分鐘0.3 mL、柱溫為30 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，理論塔板數(shù)按哈巴俄苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表4 梯度洗脫

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品參照物溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，測(cè)得峰面積RSD均小于1%，保留時(shí)間RSD<0.6%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玄參配方顆粒，按照“3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取1 μL進(jìn)樣，以哈巴俄苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.4%和1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批玄參配方顆粒，按照“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取1μL進(jìn)樣，以哈巴俄苷為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，RSD<2%，證明供試品供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 特征圖譜研究

玄參配方顆粒UPLC特征圖譜的建立與相對(duì)保留時(shí)間研究：按“3.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品參照物溶液和對(duì)照茵陳參照物溶液，按“3.2”項(xiàng)下方法制備6批樣品供試品溶液，按“3.3”項(xiàng)下色譜分析條件記錄0～20 min色譜圖，通過(guò)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，建立玄參配方顆粒UPLC特征圖譜，見(jiàn)圖3、圖4。6批玄參配方顆粒UPLC特征圖譜中，均有6個(gè)特征峰，其中，1、2、3、5號(hào)峰分別為桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，哈巴俄苷峰面積大，重現(xiàn)性好，可作為參照峰，計(jì)算4、6號(hào)峰與5號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間，在規(guī)定值的5%范圍之內(nèi)。2個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.82(峰4)、1.05(峰6)，見(jiàn)表5。

圖3 玄參配方顆粒UPLC特征圖譜

圖4 6批玄參配方顆粒UPLC特征圖譜

表5 玄參配方顆粒6個(gè)峰的保留時(shí)間 (min)

4 討論

有研究表明玄參經(jīng)炮制后可使哈巴俄苷含量下降，而使哈巴苷含量升高[5]，因此本研究將測(cè)定玄參配方顆粒中哈巴俄苷和哈巴苷的總量作為控制玄參配方顆粒質(zhì)量的方法之一。由于中藥材的復(fù)雜性，建立準(zhǔn)確有效的鑒別方法——特征圖譜，可以從客觀整體上評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量，超高效液相色譜法與普通液相色譜法相比，靈敏度更高、速度更快，因此本實(shí)驗(yàn)將UPLC定量測(cè)定和特征圖譜相結(jié)合，在測(cè)定哈巴俄苷和哈巴苷總量的基礎(chǔ)上對(duì)玄參配方顆粒特征圖譜進(jìn)行研究，為玄參配方顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。