2019 年南海北部近海水母暴發(fā)原因種的分子鑒定

杜崇, 賀君, 孫婷婷, 王雷, 王方晗, 董志軍

1. 生命科學(xué)學(xué)院, 煙臺大學(xué), 山東 煙臺 264005;

2. 牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站, 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003

近年來, 受全球氣候變化和人類活動的影響,海洋環(huán)境不斷變化并出現(xiàn)利于水母生長繁殖的趨勢,全球多處海域出現(xiàn)大型水母暴發(fā)現(xiàn)象。水母暴發(fā)導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化, 對沿海漁業(yè)生產(chǎn)和臨海工業(yè)均造成諸多負(fù)面影響(Purcell et al, 2007;Richardson et al, 2009; Purcell, 2012)。例如, 日本內(nèi)海和歐洲海域水母暴發(fā)直接導(dǎo)致當(dāng)?shù)貪O業(yè)產(chǎn)值大幅下降, 而在巴西沿海海域仙后水母(Cassiopea andromeda)大量入侵直接導(dǎo)致當(dāng)?shù)乇就留~類大量減少(Brodeur et al, 2002; Nagai, 2003; Stampar et al,2020)。在國內(nèi), 白色霞水母(Cyanea nozakii)、海月水母(Aurelia coerulea) 和沙海蜇(Nemopilema nomurai)是主要的災(zāi)害水母種類(Dong et al, 2010)。葛立軍等(2004)、李建生等(2015)調(diào)查中表明, 水母暴發(fā)海域游泳動物種類和數(shù)量明顯少于非暴發(fā)海域,導(dǎo)致當(dāng)?shù)睾Ｓ蚪?jīng)濟生物產(chǎn)量急劇下降, 對當(dāng)?shù)夭稉坪宛B(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

南海位于熱帶氣候和亞熱帶氣候交互作用區(qū)域,由于獨特的氣候特征和優(yōu)越的地理位置, 因此孕育了豐富的生物多樣性(李純厚 等, 2005; 陳清潮,2011)。南海大型水母物種豐富, 常見大型水母主要為馬來沙水母(Sanderia malayensis)、白色霞水母、紫色霞水母(Cyanea purpurea) 、 陳嘉庚水母(Acromitus tankahkeei) 、 鞭腕水母(Acromitus flagellatus)和黃斑海蜇(Rhopilema hispidum)等(陳小銀, 2011; 岑競儀 等, 2012)。水母暴發(fā)多發(fā)生在黃渤海和東海海域, 在南海海域較為少見(Dong et al,2010)。其中, 岑競儀等(2012)曾報道在海南文昌海域出現(xiàn)水母暴發(fā)現(xiàn)象, 黃斑海蜇作為原因種最大密度可達(dá)30 只·m-3。2019 年5 月在海南海口和廣東茂名附近海域均出現(xiàn)了水母暴發(fā)現(xiàn)象(聶元劍, 2019),但原因種未知。

目前, 分子生物技術(shù)的快速發(fā)展為生物物種的快速鑒定提供了新思路, 并廣泛用于水母物種的鑒定。例如, 張姝等(2009)利用線粒體 COI 和 16S rRNA 基因序列對我國海區(qū)的海蜇(Rhopilemaesculentum)和沙海蜇進行了分子鑒定, 發(fā)現(xiàn)黃海海域的沙海蜇與日本的越前水母(Nemopilema nomurai)為同一物種; Mutlu 等(2020)基于COI 基因?qū)Φ刂泻Ｎ粗高M行物種鑒定, 并將該水母命名為Chrysaora pseudoocellatasp. nov.; Seo 等(2021)基于線粒體COI 和16S rRNA 基因序列對海月水母水螅體的遺傳多樣性進行研究, 結(jié)果表明韓國海月水母(A. coerulea)的不同地理群體存在明顯的遺傳分化。因此, 本研究利用分子系統(tǒng)學(xué)鑒定技術(shù), 結(jié)合形態(tài)分類學(xué)對2019 年南海北部近海暴發(fā)水母原因種進行鑒定, 摸清南海海域水母暴發(fā)的物種種類,為深入研究南海海域災(zāi)害水母的暴發(fā)機制提供了基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月分別在海口(20°2′37″N, 110°19′18″E)、文昌(19°34′11″N, 110°49′59″E)和茂名(21°23′35″N,111°11′56″E)附近海域采集暴發(fā)水母, 每個海域各采集1 個水母個體(圖1)。對暴發(fā)水母樣品形態(tài)學(xué)鑒定和拍照記錄后, 取傘部部分組織保存在95%的乙醇中, –20℃保存。

圖1 南海采樣地點分布圖該圖基于國家測繪地理信息局標(biāo)準(zhǔn)地圖服務(wù)網(wǎng)站下載的審圖號為GS(2020)4632 的標(biāo)準(zhǔn)地圖制作, 底圖無修改Fig. 1 Map of sampling sites in the South China Sea. The map is based on the standard map downloaded from the standard map service website of the National Bureau of Surveying, Mapping and Geographic Information with the review number GS(2020)4632

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定方法

參考《中國動物志》(高尚武 等, 2002)和《World Atlas of Jellyfish》(Jarms et al, 2019)中缽水母形態(tài)與結(jié)構(gòu)的描述, 對采集水母樣品的傘部形狀大小、緣瓣形狀和數(shù)目、感受器位置數(shù)目、生殖下腔、口腕及附屬物和整體特征等進行觀察記錄。

1.3 基因組DNA 提取、擴增及測序

取出少量樣品傘部組織, 用雙蒸水反復(fù)沖洗,采用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒(天根,北京天根生化科技有限公司)對水母樣品DNA 進行提取, 基因組DNA 保存在–20℃的洗脫緩沖液中。

線粒體 C O I 基因片段擴增采用通用引物L(fēng)CO1490: 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3′; HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA-3′ (Folmer et al, 1994)。反應(yīng)體系為25μL, 包括12.5μL 2×TaqPCR StarMix, 10μmol·L–1引物各1μL, 3μL DNA 模板, 其他以滅菌超純水補足體系。擴增程序為: 94℃預(yù)變性3min, 然后35 個循環(huán)(包括94℃變性30s, 54℃退火30s), 循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min, 4℃低溫保存。線粒體16S rRNA 基因片段擴增采用引物16S-L: 5′-GACTGTTTACCA ACATA-3′; 16S-H: 5′-CATAATTCAACATCGAGGT-3′ (Ender et al, 2003)。反應(yīng)體系為25μL, 包括12.5μL 2×TaqPCR StarMix, 10μmol·L–1引物各1μL, 3μL DNA 模板, 其他以滅菌超純水補足體系。16S rRNA基因PCR 擴增程序為: 先預(yù)處理5 個循環(huán)(94℃預(yù)變性1min, 45℃退火50s, 72℃延伸1min), 然后30 個循環(huán)(包括94℃變性50s, 50℃退火1min, 72℃延伸1min), 循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min, 4℃低溫保存。PCR 擴增在Takara TP350 PCR 儀上進行。

取PCR 擴增產(chǎn)物5μL 進行1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳程序為: 電壓110V 運行30min, 在凝膠電泳成像儀器系統(tǒng)拍照記錄檢測PCR 擴增結(jié)果。將凝膠系統(tǒng)檢測含有擴增片段的樣品送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行純化和測序, 測序使用ABI 測序儀(3730xl DNA Analyer)雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件BioEdit 對DNA 序列進行人工校正和編輯, 用MEGA7 軟件對測定的樣品序列進行堿基含量分析。 在 GenBank 中收集根口水母目(Rhizostomeae)的COI 基因序列和16S rRNA 基因序列, 每個科選擇一個代表種, 共收集到11 個COI 基因序列和18 個16S rRNA 基因序列。采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 用 Bootstrap 1000 檢驗分子系統(tǒng)樹各分支置信度, 遺傳距離采用Kimura 雙參數(shù)模型計算。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母形態(tài)相同(圖2a),主要形態(tài)特征為: 水母傘部呈半球狀, 傘徑約130mm, 外傘部表面有細(xì)小顆粒。傘緣8 個感覺器,每1/8 傘緣有4 對長舌狀緣瓣。生殖下穴呈梨形突起, 彼此相通?？谕? 條, 為3 翼型, 約與傘徑等長,布滿短絲狀物, 末端有1 條鞭狀附屬物。生活時傘部有黑褐色斑點, 口腕乳白色。初步形態(tài)學(xué)鑒定, 該水母形態(tài)與鞭腕水母相似(高尚武 等, 2002; 洪惠馨, 2014; Jarms et al, 2019)。

茂名附近海域暴發(fā)水母(圖2b)不同于?？诤臀牟Ｓ虮┌l(fā)水母, 主要形態(tài)特征為: 傘部呈扁平半球狀,傘徑約120mm, 外傘部表面光滑有顆粒狀突起, 膠質(zhì)層堅硬。傘緣8 個感覺器, 緣瓣數(shù)目較多, 緣瓣之間的裂縫較深。生殖下穴呈乳狀突起, 彼此相通?？谕? 條,為3 翼型, 比傘部直徑略長, 末端逐漸變鈍, 沒有附屬物。生活時整個個體呈白色, 傘部布滿深棕色斑點。初步形態(tài)學(xué)鑒定, 該水母形態(tài)與端棍水母(Catostylus townsendi)相似(洪惠馨, 2014; Jarms et al, 2019)。

圖2 南海北部近海暴發(fā)水母形態(tài)圖a. ?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母; b. 茂名附近海域暴發(fā)水母。um 表示水母傘部, fa 表示鞭狀附屬物, oa 表示水母口腕, ml 表示緣瓣Fig. 2 Morphological character of jellyfish in the South China Sea. Jellyfish collected in Haikou and Wenchang offshore area (a), and in Maoming offshore area (b). um:umbrella; fa: flagelliform appendage; oa: oral arms; ml:marginal lappetes

2.2 分子鑒定結(jié)果

?？凇⑽牟兔浇Ｓ蛩笜悠稢OI 基因序列擴增測序長度為658bp, 上傳至GeneBank 獲得序列號MZ028018～MZ028020。海口和文昌附近海域暴發(fā)水母樣品16S rRNA 基因序列擴增測序長度為527bp, 而茂名海域暴發(fā)水母16S rRNA 基因長度為522bp, 上傳至GeneBank 獲得序列號MZ031038～ MZ031040。暴發(fā)水母COI 和16S rRNA 基因片段堿基組成顯示, 所有基因片段的A+T 含量均明顯高于C+G 含量, 表現(xiàn)出明顯的A/T 偏好, 詳細(xì)信息見表1。

表1 各地區(qū)暴發(fā)水母堿基組成及GenBank 序列號Tab. 1 Base composition and GenBank sequence number of jellyfish in different offshore areas

利用NCBI 中的BLAST (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)檢索, 與GenBank 中已記錄水母COI和16S rRNA 基因序列進行相似性比對。結(jié)果顯示,COI 基因序列對比中, 海口和文昌兩地附近海域暴發(fā)水母序列相似性高(>99.0%), 與印尼海域鞭腕水母序列(序列號: MN395685)相似性為89.9%和89.6%,而茂名附近海域暴發(fā)水母序列與印尼海域端棍水母序列(序列號: MN395693)相似性為85.9%。在16S rRNA 基因序列對比中, 海口和文昌兩地海域暴發(fā)水母序列相似性高(>99.0%), 與東太平洋的鞭腕水母序列(序列號: KY610576)相似性達(dá)到97.5%和97.7%,茂名附近海域暴發(fā)水母序列與馬六甲海峽的端棍水母序列(序列號: KY610587)相似性為93.5%。

基于COI 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, ?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母首先聚為一支, 然后和鞭腕水母匯聚成一支, 自展支持率均為100。而茂名附近海域暴發(fā)水母與端棍水母聚在一起, 自展支持率為74(圖3)。

圖3 基于COI 基因序列的根口水母目鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹圖中HK、WC 和MM 分別代表?？凇⑽牟兔浇Ｓ虮┌l(fā)水母, 各支上數(shù)據(jù)為Bootstrap 1000 給出自展支持值, 只顯示大于50的自展值Fig. 3 Neighbor joining phylogenetic tree built based on the COI sequences of Rhizostomeae. HK, WC and MM represent jellyfish in Haikou, Wenchang and Maoming offshore areas, respectively. The number on each branch is Bootstrap 1000 to give bootstrap values (only the one larger than 50 is shown)

基于16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, ?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母先聚為一支, 又與鞭腕水母聚為一支, 自展支持率均為100。茂名海域暴發(fā)水母與端棍水母聚為一支, 自展支持率為97 (圖4)。?？诤臀牟浇Ｓ蛩傅倪z傳距離是0.006, 與東太平洋鞭腕水母的遺傳距離分別為 0.025 和0.023。而茂名附近海域水母與馬六甲海峽端棍水母遺傳距離為0.048。

圖4 基于16S rRNA 基因序列根口水母目鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹圖中HK、WC 和MM 分別代表海口、文昌和茂名附近海域暴發(fā)水母, 各支上數(shù)據(jù)為Bootstrap 1000 給出自展支持值, 只顯示大于50的自展值Fig. 4 Neighbor joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of Rhizostomeae. HK, WC and MM represent jellyfish in Haikou, Wenchang and Maoming offshore areas, respectively. The number on each branch is Bootstrap 1000 to give bootstrap values (only the one larger than 50 is shown)

3 討論

水母特征通常會受到生境變化的影響, 環(huán)境的多樣性和復(fù)雜性可能使水母的形態(tài)特征發(fā)生微小的變化, 從而影響水母的鑒別和分類。所以從傳統(tǒng)的基于幾個最顯著的形態(tài)特征來鑒別物種的方法, 并不能有效解決現(xiàn)有物種鑒定的問題(Dawson et al,2001; 鄭連明 等, 2008)。近年來分子分類學(xué)快速發(fā)展, 相比于核DNA, 線粒體基因由于具有結(jié)構(gòu)簡單、進化速率高和母系遺傳等特點, 適合物種進化分析研究(Brown et al, 1979)。線粒體中的COI 基因和16S rRNA 基因序列具有高效和成本低的優(yōu)點,越來越多地被用于水母的分類研究(鄭連明 等,2008; 張姝 等, 2009; 王建艷 等, 2013; 張珰 妮 等,2015)。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù), 對南海北部近海海域的暴發(fā)水母線粒體COI 基因序列和線粒體16S rRNA 基因序列進行了測定。通過分析線粒體基因序列信息, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和計算遺傳距離, 為形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提供分子水平的分類依據(jù)。

形態(tài)學(xué)觀察顯示, 海口和文昌附近海域暴發(fā)種為同一種水母, 該物種具有傘部表面有細(xì)小顆粒和黑褐色的斑點、生殖下穴呈梨形突起、口腕布滿短絲狀物和末端有鞭狀附屬物等明顯特征, 初步判定為鞭腕水母。鞭腕水母屬于刺胞動物門(Cnidaria),缽水母綱(Scyphozoa), 根口水母目(Rhizostomeae),鞭棍水母科(Catostylidae), 端鞭水母屬(Acromitus)。鞭腕水母內(nèi)環(huán)網(wǎng)狀管和感覺輻管相連, 典型特征是口腕布滿短絲狀物并在末端有1 條鞭狀絲狀附屬物,主要分布在中國南海海域(高尚武 等, 2002; 洪惠馨, 2014; Jarms et al, 2019)。在我國南海近海海域有兩種端鞭水母, 陳嘉庚水母和鞭腕水母(高尚武 等,2002; 洪惠馨, 2014)。?？诤臀牟Ｓ蛩覆煌陉惣胃? 具有個體大(傘徑約130mm)和口腕長度略與傘徑等長的特征。因此, 初步判定?？诤臀牟Ｓ蛩笧楸尥笏?。而茂名附近海域暴發(fā)種具有外傘部表面光滑布滿褐色斑點、傘緣緣瓣數(shù)目較多裂縫較深、生殖下穴呈乳狀突起、口腕8 條沒有附屬物等特征, 與端棍水母形態(tài)相似。端棍水母屬于刺胞動物門(Cnidaria), 缽水母綱(Scyphozoa), 根口水母目(Rhizostomeae), 鞭棍水母科(Catostylidae), 端棍水母屬(Catostylus)。端棍水母內(nèi)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)寬網(wǎng)眼大, 內(nèi)網(wǎng)絡(luò)直接與感覺器和間輻管連接, 外網(wǎng)延伸到緣瓣, 網(wǎng)眼小, 口腕沒有附屬物(洪惠馨, 2014; Jarms et al, 2019)。

基于線粒體基因堿基組成顯示, 兩種水母兩種線粒體基因均表現(xiàn)出較高的A+T 的含量, 符合水母類線粒體基因組A+T 含量普遍偏高的特點(程方平 等, 2012; Dong et al, 2015; 劉青青 等,2018)?；诰€粒體 COI 基因序列和線粒體 16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示, ?？?、文昌和茂名附近海域暴發(fā)水母基因序列明顯分為兩支, ?？诤臀牟乃赶染墼谝黄鸷笈c鞭腕水母聚到一支, 說明?？诤臀牟Ｓ蛩概c鞭腕水母關(guān)系十分接近。而茂名附近海域水母和端棍水母聚為一支, 說明茂名附近海域水母與端棍水母有較近的親緣關(guān)系。基于線粒體16S rRNA 基因序列的遺傳距離顯示, ?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母間的遺傳距離為0.006, 基因序列差異很低屬于種內(nèi)遺傳差異, 可以認(rèn)為海口和文昌附近海域暴發(fā)水母為同一種。而?？诤臀牟Ｓ蛩概c東太平洋鞭腕水母遺傳距離為0.025 和0.023, 茂名海域水母與馬六甲海峽端棍水母遺傳距離是0.048?；诰€粒體16S rRNA 基因的研究結(jié)果顯示水螅水母的種內(nèi)遺傳距離為0～0.047, 而立方水母和缽水母的種內(nèi)遺傳距離在0～0.05 之間( 張珰 妮 等, 2015; 劉瑞娟 等, 2016)。因此, 本研究中?？诤臀牟Ｓ虮┌l(fā)水母與東太平洋鞭腕水母間的遺傳分化可以認(rèn)為是種內(nèi)遺傳分化。而茂名海域暴發(fā)水母與馬六甲海峽端棍水母遺傳分化程度較大, 推測茂名海域暴發(fā)水母可能為端棍水母隱存種。本研究還揭示水母線粒體16S rRNA 基因比線粒體COI 基因更保守, 適合水母分子系統(tǒng)分類的研究, 這和何勁儒(2014)的研究結(jié)論一致。

結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果, 本研究從分子水平上證實?？诤臀牟浇Ｓ虮┌l(fā)水母為鞭腕水母(Acromitus flagellatus), 而茂名附近海域暴發(fā)水母為端棍水母(Catostylussp.)。本研究鑒定了2019 年5月南海多地出現(xiàn)水母暴發(fā)的原因種, 摸清南海北部海域暴發(fā)水母物種種類, 為深入研究南海海域災(zāi)害水母的暴發(fā)機制提供了基礎(chǔ)信息。