馬家柚遺傳來源鑒定與適宜授粉品種篩選

徐宸宇，曹立新，唐啟正，吳巨勛，伊華林

園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070

馬家柚［Citrus grandis（L.）Osbeck cv‘Majia pomelo’］是研究人員于1991年對(duì)江西省柚類資源普查時(shí)發(fā)現(xiàn)的地方性特色柚類品種，因其汁多瓤紅、細(xì)嫩爽口、清香四溢、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高以及適宜Ⅱ型糖尿病患者食用等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛栽種于廣豐及其周邊地區(qū)居民的房前屋后，其母樹現(xiàn)位于廣豐縣大南鎮(zhèn)［1］。但目前對(duì)于馬家柚遺傳起源以及原產(chǎn)地周邊區(qū)域的柚類資源和主要柚類株系間的親緣關(guān)系尚不明晰，劉勇［2］在對(duì)全國(guó)122 份柚類資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析時(shí)僅得出馬家柚與廣豐周邊地區(qū)的信木柚共同歸屬于其他雜種柚類品種群的結(jié)論，馬家柚遺傳背景研究的不足已明顯制約了馬家柚優(yōu)良品種的發(fā)掘與產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)一步發(fā)展。經(jīng)長(zhǎng)期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，馬家柚在形態(tài)與品質(zhì)上與周邊地區(qū)的本地土柚存在一定的相似性，研究人員推測(cè)馬家柚與地方土柚的遺傳關(guān)系接近或直接經(jīng)土柚變異而來。由于自然和人為的雙重選擇會(huì)導(dǎo)致實(shí)生繁育馬家柚產(chǎn)生大量變異株系，這些變異個(gè)體間往往差異明顯，同時(shí)因生產(chǎn)中苗木混雜進(jìn)而導(dǎo)致栽培株系間品質(zhì)不一致［3］。

前人就馬家柚提質(zhì)增產(chǎn)開展了大量研究，單一栽培模式下的馬家柚有籽無籽性狀不穩(wěn)定，無籽果實(shí)風(fēng)味較淡且容易產(chǎn)生?；F(xiàn)象。目前主栽馬家柚品系還存在著果皮過厚，平均厚度可達(dá)30～35 mm；果形不統(tǒng)一，多為梨形或高扁圓形；果皮油胞大小與排布不均，果皮光滑度不一致；果實(shí)品質(zhì)差異較大等問題［4］?，F(xiàn)針對(duì)于馬家柚品質(zhì)改良的最佳方式是通過雜交授粉使單一品系栽種的無籽馬家柚產(chǎn)生一定數(shù)量的種籽，雜交授粉作為直接影響主要糧食、經(jīng)濟(jì)林木、果蔬及園藝觀賞植物的產(chǎn)量及品質(zhì)性狀的重要栽培措施，對(duì)作物改良、提質(zhì)增產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益的提升發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［5-7］。育種人員通過對(duì)不同親本雜交后代性狀觀察分析，篩選出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病抗除草劑、根系發(fā)達(dá)、抗旱耐鹽堿、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量高、耐貯運(yùn)、品質(zhì)優(yōu)異等針對(duì)多樣化育種目標(biāo)的優(yōu)勢(shì)品種［8-10］。例如雜交授粉后產(chǎn)生的大量種籽可通過影響果實(shí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和內(nèi)源激素調(diào)節(jié)果實(shí)滲透物質(zhì)含量共同起到保護(hù)中心柱的作用，降低柚果實(shí)內(nèi)裂率［11-12］。在花粉直感作用下，以優(yōu)質(zhì)品種為父本可有效實(shí)現(xiàn)待授粉品種改良，提升果實(shí)外觀及內(nèi)在風(fēng)味品質(zhì)、增強(qiáng)品種市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力［13-15］，這在多個(gè)物種中已得到了廣泛應(yīng)用［16-18］。研究表明有籽馬家柚果皮光滑且風(fēng)味較無籽馬家柚更為濃郁，同時(shí)馬家柚種籽數(shù)量與父本密切相關(guān)。以枳殼為父本與馬家柚進(jìn)行授粉時(shí)平均每果種籽數(shù)僅為20余粒，而以沙田柚、江壩柚和龍回早柚為父本時(shí)的平均每果種籽數(shù)高達(dá)200 余粒。同時(shí)以不同父本雜交授粉后的馬家柚在坐果率、果皮厚度、果皮色澤、果形、可滴定酸、可溶性固形物和維生素C 等綜合品質(zhì)上差異顯著［19］。隨著雜交組合的增多，不同雜交父本授粉馬家柚的農(nóng)藝性狀差異得以體現(xiàn)，但對(duì)于雜交父本的選擇多為隨機(jī)選擇。此外，對(duì)馬家柚原產(chǎn)地周邊主要柚類資源搜集和梳理工作的滯后進(jìn)一步阻礙了本土柑橘資源的開發(fā)與利用。

基于此，本研究通過對(duì)廣豐縣和周邊地區(qū)以及其他省份收集的46 份柚資源的遺傳關(guān)系分析，探明馬家柚起源及其不同株系親緣關(guān)系，并以此為依據(jù)選擇馬家柚近緣系和遠(yuǎn)緣系作為授粉親本與主栽馬家柚株系進(jìn)行授粉試驗(yàn)，探究遺傳關(guān)系不同株系授粉對(duì)馬家柚品質(zhì)影響，旨在為馬家柚優(yōu)質(zhì)高效栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）遺傳分析材料。46 份柚（Citrus grandisOsbck）資源樣品分別取自江西省新余市、上饒市廣豐縣及周邊區(qū)縣、湖北省宜昌市、湖南省郴州市以及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘資源圃（表1），全部土柚和馬家柚母樹為實(shí)生繁殖，均來自江西廣豐，其他材料為嫁接繁育。選取柚類樣品葉型完整、無病蟲害的幼嫩葉片，用自封袋封存后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清水沖洗并吸干水分，隨后立即提取葉片DNA 或置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 46份柚資源名稱及來源Tabel 1 Name and source of the 46 pomelo varieties

續(xù)表1 Continued Table 1

2）授粉材料與方法。雜交授粉試驗(yàn)中母本為江西省廣豐縣湖豐鎮(zhèn)馬家柚基地中經(jīng)嫁接繁育的10年生馬家柚成年結(jié)果樹（馬家柚1號(hào)），樹勢(shì)強(qiáng)健且無明顯病蟲害。父本分別選擇周邊區(qū)縣的土柚1 號(hào)～土柚4 號(hào)（簡(jiǎn)稱為N1、N2、N3、N4）和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘資源圃中的HB 柚（簡(jiǎn)稱為HB）與雞尾葡萄柚（簡(jiǎn)稱為JW）。于盛花期前選取同一株母本樹上的健壯花序，對(duì)即將開放的花朵進(jìn)行人工去雄并對(duì)上述花粉分別進(jìn)行雜交授粉處理，對(duì)授粉花朵數(shù)與雜交組合統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行掛牌并疏除其余未授粉花朵。每單株作為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3 株樹，對(duì)照組為每株樹上的自然傳粉果實(shí)。

1.2 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

參考程運(yùn)江等［20］的方法，并略做簡(jiǎn)化。CTAB法微量提取46份柚類資源DNA。

1.3 SSR分子標(biāo)記分析

1）SSR 引物的篩選。應(yīng)用柑橘相關(guān)研究中的SSR 分子標(biāo)記引物并結(jié)合劉勇［2］在柚類資源多樣性中的遺傳多態(tài)信息指數(shù)，最終篩選出帶型清晰的12對(duì)SSR 引物。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司（上海合成部）合成，引物序列見表2。

表2 本研究中篩選得到的12對(duì)SSR引物Table 2 12 pairs of primers selected in the study for SSR

2）DNA 擴(kuò)增體系為20 μL。TaqDNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，正反引物（10 μmol/L）各0.3 μL、dNTPs（2.5 ng/μL）1.6 μL、DNA 模板（25ng/μL）2.6 μL、10×反應(yīng)緩沖液、ddH2O 13.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。全部反應(yīng)均在ABI Veriti 梯度PCR 儀上進(jìn)行。

1.4 果實(shí)綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)

1）果實(shí)外觀品質(zhì)。取大小一致的5 個(gè)果實(shí)測(cè)定單果質(zhì)量、縱橫徑、果皮厚度和單果種籽數(shù)。分別用電子天平和游標(biāo)卡尺測(cè)量單個(gè)果實(shí)的質(zhì)量、縱橫徑和果皮厚度；記錄5 個(gè)果實(shí)種籽總數(shù)量并求其均值；果形指數(shù)為縱徑/橫徑［21］。

2）果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。測(cè)定5個(gè)果實(shí)的可食率、出汁率和維生素C 含量；可溶性固形物（soluble solids，TSS）使用便攜式折光儀對(duì)5個(gè)果實(shí)的混合果汁平行測(cè)定3 次并取其均值；可滴定酸（titratable acids，TA）使用全自動(dòng)電位滴定儀測(cè)定［22-23］。

3）果肉可溶性糖及有機(jī)酸含量測(cè)定。果實(shí)糖酸提取參照許讓偉等［24］的方法。GC檢測(cè)條件：HP5色譜柱（5% Phenylmethyl polysiloxane，30 m×25 μm i.d×0.1 μm），分流/不分流進(jìn)樣口溫度270 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃。氣體流速：高純N2作載氣，流量為45 mL/min；H2的流量為40 mL/min；空氣流量為450 mL/min；柱頭壓為0.827 MPa，進(jìn)樣量1 μL，分流比30∶1，分流流速為60.1 mL/min。升溫程序：初溫130 ℃，以8 ℃/min 升至152 ℃，12 ℃/min 升至176 ℃，16 ℃/min 升至198 ℃，以20 ℃/min 升至238 ℃，24 ℃/min 升至280 ℃，在280 ℃保留4 min，最高溫度不超過325 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

參考Zhen 等［25］的方法以每個(gè)樣品在不同位點(diǎn)上擴(kuò)增條帶的有無進(jìn)行賦值，有條帶賦值為1，無條帶則賦值為0，構(gòu)建“01”數(shù)據(jù)矩陣。通過NTSYS2.10e 軟件進(jìn)行柚資源樣品的聚類分析，兩兩樣品間的遺傳差異按照Qualitative data 中的簡(jiǎn)單匹配系數(shù)計(jì)算，通過Zhen 等［25］中UPGMA 對(duì)所得的遺傳相似性系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類分析，Graphics 繪制樹狀圖。品質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果使用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，Prism軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬家柚親緣關(guān)系分析

根據(jù)12 組SSR 引物對(duì)46 份柚類資源擴(kuò)增的條帶構(gòu)建每個(gè)樣品特有的指紋圖譜，聚類分析后最終繪制出46 份柚類資源的SSR 分子標(biāo)記聚類樹狀圖。聚類結(jié)果分析如下。

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.643時(shí)，全部46份柚類資源樣品被分為3大類。第Ⅰ組為馬家柚、HB柚、琯溪蜜柚等柚類在內(nèi)的多品種群，共計(jì)44 個(gè)柚資源。第Ⅱ組為胡柚，第Ⅲ組則為雞尾葡萄柚。

圖1 馬家柚親緣關(guān)系SSR標(biāo)記聚類樹狀圖Fig.1 Tree diagram of genetic relationship of Majia pomelo using SSR markers clustering

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.815 時(shí)分為8 個(gè)亞組，第Ⅰ亞組為馬家柚母樹、馬家柚1～5 號(hào)、土柚1 號(hào)、土柚4號(hào)、土柚9 號(hào)、土柚20 號(hào)、HB 柚、強(qiáng)德勒柚、資丘琯溪蜜柚等14個(gè)品種，主要為馬家柚品種群；第Ⅱ亞組為土柚11號(hào)；第Ⅲ亞組為琯溪蜜柚、信木柚、沙田柚、新余柚1 號(hào)、華農(nóng)紅柚、鳳凰柚、土柚2 號(hào)、土柚3 號(hào)、土柚13 號(hào)、土柚19 號(hào)等23 個(gè)品種，主要為獨(dú)立柚類與部分土柚品種群；第Ⅳ亞組為土柚5 號(hào)、土柚21 號(hào)等5個(gè)品種，為土柚品種群；第Ⅴ亞組為土柚10號(hào)；第Ⅵ亞組為土柚12號(hào)；第Ⅶ亞組為胡柚；第Ⅷ亞組為雞尾葡萄柚。由聚類樹狀圖可得出：（1）馬家柚1號(hào)、馬家柚3 號(hào)、馬家柚5 號(hào)和馬家柚母樹相似系數(shù)為1，推測(cè)為同一實(shí)生品系。（2）相似系數(shù)為0.901 時(shí)，土柚4 號(hào)與馬家柚母樹聚為一類；土柚1 號(hào)與馬家柚2 號(hào)、馬家柚4 號(hào)在相似系數(shù)為0.895 時(shí)聚為一類；土柚9 號(hào)、HB 柚在相似系數(shù)為0.827 時(shí)和馬家柚母樹聚為一類；土柚2 號(hào)與信木柚在相似系數(shù)為0.889 時(shí)聚為一類；土柚3 號(hào)在相似系數(shù)為0.839 時(shí)才與馬家柚聚為同一類。（3）胡柚（相似系數(shù)0.630）、雞尾葡萄柚（相似系數(shù)0.617）與馬家柚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

上述結(jié)果表明：土柚4號(hào)與馬家柚母樹親緣關(guān)系十分相近；馬家柚2 號(hào)、馬家柚4 號(hào)相較于馬家柚母樹存在一定程度的變異；土柚1 號(hào)與馬家柚2 號(hào)、馬家柚4 號(hào)親緣關(guān)系較近；馬家柚并非由HB 柚、強(qiáng)德勒柚、沙田柚、信木柚和琯溪蜜柚等任何一個(gè)品種變異而來；雞尾葡萄柚、胡柚與馬家柚均為獨(dú)立品種。推測(cè)最早的實(shí)生馬家柚極可能經(jīng)廣豐及周邊地區(qū)土柚變異而來。

2.2 部分有食用價(jià)值的柚資源品質(zhì)分析

對(duì)廣豐及周邊地區(qū)果實(shí)品質(zhì)性狀表現(xiàn)較好、并具有一定食用價(jià)值的部分資源和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘資源圃內(nèi)對(duì)照組的柚類品種（表3 中14～18 號(hào)）共18份柚類資源的常規(guī)品質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明：馬家柚周邊柚種質(zhì)資源類型呈高度多樣化，在品質(zhì)相關(guān)性狀（表3）如單果質(zhì)量（472.2 ～1 482.7 g）、果皮厚（0.92 ～3.45 cm）、種籽數(shù)（0 ～158.7個(gè)）、可滴定酸含量（0.53%～2.48%）、VC（37.1 ～90.5 mg/100 g）、出汁率（14.7%～40.5%）等方面均存在著明顯差異。當(dāng)?shù)罔仲Y源調(diào)查結(jié)果反映出廣豐及周邊馬家柚產(chǎn)區(qū)的柚類資源豐富，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些優(yōu)良的土柚品種，如風(fēng)味濃郁、高維生素C 含量的土柚4號(hào)；對(duì)照組品種中HB 柚風(fēng)味足、種籽少，也可作為適宜授粉候選品種。

表3 18個(gè)優(yōu)良柚資源常規(guī)品質(zhì)分析Table 3 Analysis of conventional quality of 18 excellent pomelo resource

2.3 馬家柚適宜授粉資源初選

1）6 個(gè)雜交授粉父本對(duì)馬家柚果實(shí)外觀品質(zhì)影響。綜合評(píng)估46份柚類資源中部分品質(zhì)性狀及花粉收集便利性，最終選擇以品質(zhì)性狀優(yōu)良的土柚4號(hào)和HB 柚；馬家柚近緣系品種土柚1號(hào)、土柚2號(hào)、土柚3號(hào)以及遠(yuǎn)緣系品種雞尾葡萄柚（CG）為父本與主栽馬家柚進(jìn)行雜交授粉，授粉果實(shí)的外觀品質(zhì)分析結(jié)果（表4）顯示：6個(gè)雜交授粉組合果實(shí)種籽數(shù)較CK的無籽果實(shí)相比均極顯著增加，其中土柚系（N1、N2、N3、N4）為父本時(shí)使果實(shí)平均種籽數(shù)增加至200 余粒；HB 為父本時(shí)果實(shí)種籽數(shù)較少，平均為135.56 粒；CG 授粉果實(shí)種籽數(shù)最少。對(duì)單果質(zhì)量的提升以HB最為顯著，N2、N1 次之。果皮厚度方面，除CG 外的其余雜交組合較CK 均顯著降低馬家柚的果皮厚度。在果形指數(shù)上，雜交授粉處理較CK均無顯著差異。

表4 6個(gè)雜交父本授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)外觀品質(zhì)分析Table 4 Analysis on exterior quality of pollinated fruits of six hybrid male parents and the control

2）6 個(gè)雜交授粉父本對(duì)馬家柚果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)影響。6 個(gè)雜交授粉處理果實(shí)可食率與自然授粉果實(shí)（CK）相比均無顯著性差異；HB 為父本時(shí)可顯著提升授粉馬家柚出汁率；可溶性固形物（TSS）含量方面，CG 后代果實(shí)TSS 含量為16.90%，較CK 果實(shí)TSS 含量有顯著性提升，其余雜交父本則無明顯差異；4個(gè)土柚系（N1、N2、N3、N4）和HB為父本時(shí)授粉果實(shí)與CK 相比均顯著降低了果實(shí)可滴定酸（TA）含量，而CG 雜交后代果實(shí)則表現(xiàn)為TA 含量的顯著升高；土柚系雜交父本較CK 相比均顯著提升了授粉果實(shí)固酸比，有效改善了果實(shí)風(fēng)味，其中以CG 為父本時(shí)顯著降低了果實(shí)固酸比，使果實(shí)風(fēng)味明顯變淡；6個(gè)雜交授粉父本中以N3 對(duì)果實(shí)VC含量提升效果最佳，除HB 外的其余雜交父本與CK 相比均顯著提升了果實(shí)VC含量（表5）。

表5 6個(gè)雜交父本授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)分析Table 5 Analysis on inner quality of pollinated fruits of six hybrid male parents and the control

3）雜交授粉果實(shí)可溶性糖含量分析。對(duì)構(gòu)成馬家柚糖酸風(fēng)味的主要組分的測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示，馬家柚果肉可溶性總糖含量變化趨勢(shì)總體上與可溶糖各組分間保持一致，土柚系（N1、N2、N3、N4）雜交父本和CG 對(duì)可溶性糖組分中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量提升效果顯著；6 個(gè)雜交父本授粉均顯著提升了馬家柚果實(shí)總糖含量，其中N1、CG、N3和N4可溶性總糖含量與CK 相比，增幅分別可達(dá)102.7%、99.6%、82.6%和78.2%。

圖2 6個(gè)雜交父本授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)可溶性糖含量分析Fig.2 Analysis of soluble sugar content in pollinated fruits of six hybrid male parents and the control

4）雜交授粉果實(shí)有機(jī)酸含量分析。檸檬酸為構(gòu)成馬家柚果實(shí)有機(jī)酸的主要組分，由圖3 可知：不同雜交授粉馬家柚的總有機(jī)酸含量與檸檬酸含量變化趨勢(shì)保持一致。與CK 相比，4 個(gè)土柚系（N1、N2、N3、N4）父本均在一定程度上增加了果肉中的有機(jī)酸含量，其中以N3 的提升幅度最大，N4 次之；CG 顯著提升了馬家柚果肉中檸檬酸與總酸含量，總有機(jī)酸含量增幅高達(dá)98.4%；HB則與CK無明顯變化。

圖3 6個(gè)雜交父本授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)有機(jī)酸含量分析Fig.3 Analysis on organic acid content in pollinated fruits of six hybrid male parents and the control

綜合而言，馬家柚果實(shí)外觀品質(zhì)中以HB 綜合表現(xiàn)最佳，N1、N2、N3 次之；CG 為父本授粉后果實(shí)存在果皮較厚與果實(shí)重量較輕的缺點(diǎn)。內(nèi)在品質(zhì)中以土柚系（N1、N2、N3、N4）綜合表現(xiàn)較好，其中以N3在固酸比和VC含量上表現(xiàn)最佳；HB 和CG 的固酸比較低導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味較淡以及果實(shí)VC含量偏低；CG為父本授粉后的果實(shí)可滴定酸含量較CK 顯著增加則會(huì)導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味偏酸。糖酸風(fēng)味方面以糖酸比為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中N1、N4 的綜合表現(xiàn)最佳，N2 和N3 次之；HB 為父本授粉后果實(shí)糖酸風(fēng)味偏淡，CG授粉后果實(shí)酸含量較高，口感偏酸。綜合馬家柚各項(xiàng)品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，以N1、N4 為父本與主栽馬家柚雜交授粉果實(shí)綜合品質(zhì)明顯優(yōu)于其他組合，可作為候選雜交組合進(jìn)行父本復(fù)選。

2.4 馬家柚適宜授粉父本復(fù)選

1）雜交父本N1、N4對(duì)馬家柚外觀品質(zhì)影響。第2 年以授粉綜合品質(zhì)更為優(yōu)良的2 個(gè)雜交父本N1、N4 進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，連續(xù)2 a 的品質(zhì)測(cè)定結(jié)果（表6）表明：N1、N4 對(duì)于馬家柚外觀品質(zhì)中單果質(zhì)量的提升以及種籽數(shù)的增加表現(xiàn)穩(wěn)定，同時(shí)N1、N4連續(xù)2 a均一定程度降低了馬家柚果皮厚度，其中N4 對(duì)馬家柚果皮厚度降低效果為兩者中最佳。

表6 雜交父本N1、N4授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)外觀品質(zhì)分析Table 6 Analysis on exterior quality of pollinated fruits of hybrid male parents N1，N4 and the control

2）雜交父本N1、N4對(duì)馬家柚內(nèi)在品質(zhì)影響。連續(xù)2 a的雜交授粉處理果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)結(jié)果表明（表7）：N1、N4 較CK 相比在TSS 含量上均無顯著變化，但均有效降低了果實(shí)TA 含量，同時(shí)N1、N4 在固酸比方面均有明顯提升，有效改善了果實(shí)風(fēng)味。N1、N4 連續(xù)2 a 均顯著增加了果實(shí)VC含量。

表7 雜交父本N1、N4授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)分析Table 7 Analysis on inner quality of pollinated fruits of hybrid male parents N1，N4 and the control

3）雜交果實(shí)可溶性糖含量。由圖4可知，雜交授粉后馬家柚果實(shí)可溶性總糖與果糖、葡萄糖和蔗糖含量保持相對(duì)一致，其中N4 顯著提升了果實(shí)可溶性糖各組分含量，分別在果糖、葡萄糖、蔗糖和總糖含量上較CK 增長(zhǎng)了32.9%、32.0%、16.7%和23.0%，N1 較CK 則無顯著性差異。

圖4 雜交父本N1、N4授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)可溶性糖含量分析Fig.4 Analysis of soluble sugar content of pollinated fruits of hybrid male parents N1，N4 and the control

4）雜交果實(shí)有機(jī)酸含量。有機(jī)酸含量方面，N4在檸檬酸及總酸含量較CK 相比有一定程度的降低，N1 在有機(jī)酸各組分含量上較CK 均無顯著性差異（圖5）。

圖5 雜交父本N1、N4授粉果實(shí)及對(duì)照果實(shí)有機(jī)酸含量分析Fig.5 Analysis on organic acid content of pollinated fruits of hybrid male parents N1，N4 and the control

馬家柚適宜授粉父本的復(fù)選結(jié)果表明：果實(shí)外觀品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)中，2 個(gè)候選父本授粉果實(shí)品質(zhì)含量差異在不同年份間基本保持一致。但與2019 年相比，N1、N4 在果實(shí)質(zhì)量上的增幅高達(dá)62.3% 和54.0%，果實(shí)體積的明顯膨大進(jìn)而導(dǎo)致了果皮明顯增厚；單果種籽數(shù)總體較上年相比有所減少，但N1、N4間并無顯著差異。果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)方面，N1、N4 的可食率和出汁率連續(xù)2 a 的測(cè)定結(jié)果并無明顯差異。N1、N4 授粉果實(shí)的TSS 含量均較CK 無顯著性差異，但兩者均顯著降低了果實(shí)TA 含量；糖酸風(fēng)味方面，N4對(duì)馬家柚的增糖降酸效果顯著，有效提升了果實(shí)風(fēng)味。

綜合連續(xù)2 a對(duì)不同雜交父本授粉的馬家柚果實(shí)各類品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)可以得出：在生產(chǎn)中優(yōu)先選擇與主栽品種親緣關(guān)系較近，同時(shí)對(duì)于當(dāng)?shù)剡m應(yīng)性強(qiáng)的本地土柚作為授粉材料時(shí)，可有效改善果實(shí)綜合品質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)主栽品種的提質(zhì)增產(chǎn)目標(biāo)。本研究中，以土柚4 號(hào)為父本與主栽馬家柚（馬家柚1 號(hào)）進(jìn)行雜交后果實(shí)品質(zhì)提升效果最佳，可進(jìn)行大規(guī)模推廣應(yīng)用。

3 討 論

前人研究表明世界上柚類大體可分為內(nèi)陸性和海洋性兩類，其中內(nèi)陸性柚為較原始的類群，由于內(nèi)陸不同于海洋性柚類存在地理位置上的明顯割裂而阻斷不同柚品種間的基因交換，因此，內(nèi)陸性柚類具有更高的遺傳多樣性［26］。以我國(guó)為例，研究人員將秦嶺淮河及長(zhǎng)江中下游平原以南劃分為內(nèi)陸性柚類區(qū)域，涉及的產(chǎn)區(qū)有四川、湖南、湖北、江西、廣西以及云貴地區(qū)。海洋性柚類所在區(qū)域?yàn)槲覈?guó)沿海地區(qū)，包括浙江、福建、廣東、海南以及臺(tái)灣地區(qū)［27］。廣豐馬家柚所在的江西省作為典型的內(nèi)陸性地區(qū)，在漫長(zhǎng)的自然實(shí)生繁育和人為選育的共同影響下形成了豐富的品種性狀多樣性，柚類所具有的單胚性狀也進(jìn)一步促進(jìn)了遺傳上高度雜合的可能。在人為因素的作用下，不同省/自治區(qū)間柚類資源的廣泛交換也加劇了地方柚類品種遺傳背景的復(fù)雜性。本研究中的聚類結(jié)果表明，馬家柚母樹與HB 柚（相似系數(shù)0.827）、琯溪蜜柚（相似系數(shù)0.815）、信木柚（相似系數(shù)0.790）、沙田柚（相似系數(shù)0.778）、雞尾葡萄柚（相似系數(shù)0.617）等品種有一定的遺傳相似度但并非由其中任何一個(gè)品種變異而來。馬家柚母樹與馬家柚2號(hào)、馬家柚4號(hào)、土柚1號(hào)和土柚4號(hào)親緣關(guān)系極近，同時(shí)本研究搜集到的土柚材料大都與信木柚、琯溪蜜柚、HB 柚等獨(dú)立柚類品種聚為一類。以上結(jié)論表明廣豐周邊的本地土柚遺傳變異幅度較大，同時(shí)我們了解到，廣豐縣為發(fā)展當(dāng)?shù)罔之a(chǎn)業(yè)曾于1990 年先后引進(jìn)了一批外來柚類品種。據(jù)此推測(cè)，當(dāng)年引進(jìn)的外來柚類可能為上述品種中的一種或幾種，而馬家柚極有可能為本地土柚在長(zhǎng)期實(shí)生繁育過程中因人為干預(yù)導(dǎo)致的區(qū)域性柚類種質(zhì)資源豐富度上升進(jìn)而逐漸演變?yōu)槿缃竦闹髟云废怠?duì)于馬家柚起源背景的最終確定還有待通過形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)和基因組學(xué)等多角度進(jìn)行更為全面的比對(duì)判斷［28-30］。

馬家柚果實(shí)相關(guān)性狀的花粉直感效應(yīng)受到遺傳基因的影響。46 份柚類資源的遺傳關(guān)系研究表明，與主栽馬家柚親緣關(guān)系相近的部分土柚作為廣豐及周邊鄉(xiāng)縣的原始柚類類群，對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境適應(yīng)性以及抗逆性較強(qiáng)同時(shí)具有一定的食用價(jià)值，適宜作為授粉材料加以開發(fā)利用。這種利用果實(shí)不同親緣關(guān)系的授粉品種進(jìn)行主栽品系品質(zhì)改良已得到證明。如，采用與蜜梨親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的砂梨等品種授粉可提升單果質(zhì)量和可溶性固形物含量，以親緣關(guān)系較近的白梨等品種為父本時(shí)則可有效保持蜜梨果形［31］。因單一栽培下的馬家柚果實(shí)品質(zhì)差異較大，通過連續(xù)2 a的雜交授粉試驗(yàn)篩選出的土柚4號(hào)可有效改善馬家柚主栽品系的果皮過厚、可食率較低以及風(fēng)味偏淡等品質(zhì)缺陷，同一產(chǎn)區(qū)不同個(gè)體以及不同產(chǎn)區(qū)間果實(shí)差異進(jìn)一步縮小，品種性狀趨于穩(wěn)定［32］。

授粉后果實(shí)種籽數(shù)的大幅度提升往往易受到消費(fèi)者詬病。但本研究注意到因異源花粉導(dǎo)致馬家柚由無籽增加至100多顆種籽后，其果實(shí)可食率反而有一定的增加。可食率的增加推測(cè)是由于種籽的出現(xiàn)造成果實(shí)內(nèi)源激素含量變化，進(jìn)而促進(jìn)了膨大期果肉組織的發(fā)育，使白皮層受到汁胞的持續(xù)膨脹壓縮最終導(dǎo)致了果皮厚度的降低。此外，因馬家柚種籽緊密分布在果實(shí)中心柱周圍［33-34］，種籽易于直接剝離，同樣也避免了食用便利性的下降。然而，適宜作為授粉材料的本地土柚的花期與主栽馬家柚品系相隔1周左右，如遇花期不良?xì)夂騽t會(huì)造成傳粉效果不佳，進(jìn)而影響當(dāng)年產(chǎn)量。同時(shí)我們注意到，因風(fēng)味苦澀、果面粗糙、油胞組織大而突出以及果實(shí)酸含量偏高而不直接用于栽培售賣的粗皮馬家柚在部分果園中被做為主栽馬家柚的授粉樹進(jìn)行利用，粗皮馬家柚與主栽馬家柚品系花期一致并可使其產(chǎn)生一定數(shù)量的種籽［35］?？紤]到消費(fèi)者感官評(píng)價(jià)的主導(dǎo)性，如何實(shí)現(xiàn)在進(jìn)一步減少雜交授粉后的馬家柚種籽數(shù)量的情況下同時(shí)使得果實(shí)風(fēng)味不斷提升這一育種目標(biāo)就顯得尤為關(guān)鍵。雜交親本和授粉方式的不同可直接影響果實(shí)種籽數(shù)量，其中可溶性淀粉介質(zhì)花粉輔助授粉和人工搖粉較自然授粉可顯著提高煙草種籽產(chǎn)量和單果粒數(shù)［36］。生產(chǎn)中，粗皮馬家柚周圍的主栽馬家柚因距離的遠(yuǎn)近導(dǎo)致授粉效果差異進(jìn)而直接影響果實(shí)種籽數(shù)量和種籽性狀，如種籽的空癟和敗育等。但目前鮮有授粉方式和授粉樹配置情況如何影響雜交果實(shí)種籽數(shù)的相關(guān)研究，后期我們還將通過對(duì)比粗皮馬家柚和土柚2 種雜交父本授粉后的馬家柚品質(zhì)差異并結(jié)合開展授粉樹配置相關(guān)研究以及液體輔助授粉、蟲媒傳粉等多種形式以進(jìn)一步確定馬家柚最佳授粉親本和適宜的雜交授粉方式。