鱘魚皮中二肽基肽酶-IV抑制肽的分離純化與鑒定

尹 劍，武瑞赟，胡錦蓉，李平蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

由于人民生活水平的不斷提高，高蛋白、高糖飲食的增加，癌癥、糖尿病的發(fā)病率日益增加。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告，2017年全球范圍內(nèi)，平均每11 個(gè)成年人就有1 個(gè)糖尿病患者，2019年我國(guó)20～79 歲成年人中約1.28億 人患有糖尿病，位居全球第一[1]，糖尿病已經(jīng)成為21世紀(jì)人類面臨的最重要的全球性健康問(wèn)題之一。糖尿病是由于機(jī)體內(nèi)胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗而引起的一種代謝疾病，根據(jù)發(fā)病原因分為I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。其中，II型糖尿病主要的發(fā)病人群為成年人，占糖尿病人數(shù)的90%以上，其發(fā)病后期會(huì)產(chǎn)生多種并發(fā)癥，因此，II型糖尿病的治療尤為關(guān)鍵。常見的II型糖尿病的治療方式主要以口服降血糖藥物或注射胰島素等為主，例如促胰島素分泌劑、提高胰島素敏感性類藥物、減緩碳水化合物吸收類藥物和胰島素及其類似物等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對(duì)糖尿病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，目前已開發(fā)出多種針對(duì)不同靶點(diǎn)的糖尿病治療藥物，如二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）抑制劑，它是通過(guò)延長(zhǎng)具有刺激胰島素分泌、抑制餐后胰高血糖素分泌功能的腸降血糖素的壽命達(dá)到降血糖的功效[2-5]。但是，由于提取、生產(chǎn)等的局限性，臨床上常見的DPP-IV抑制劑主要通過(guò)化學(xué)合成制備得到，長(zhǎng)期使用對(duì)機(jī)體的毒副作用較大[6-7]。因此分離提取得到安全有效的DPP-IV抑制活性肽，開發(fā)出具有高效低毒性的降血糖功能食品[8-13]成為了新的研究熱點(diǎn)。

魚皮作為水產(chǎn)品加工過(guò)程的副產(chǎn)物，直接丟棄會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，目前行業(yè)中僅有很少量的魚皮被制作成皮革制品得以加工利用[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，魚皮中膠原蛋白含量豐富，具有抗菌、抗氧化、降血壓、降血糖等多種功能[15-16]。劉東陽(yáng)[17]以馬鮫魚魚皮為原料，采用磁性固定化酶法和膜分離方式相結(jié)合的工藝制備出抗菌肽及抗氧化肽。華鑫[18]首先利用胰蛋白酶酶解羅非魚魚皮，再利用陽(yáng)離子交換柱、凝膠過(guò)濾層析法和反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等手段分離純化血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性肽。以上研究表明，魚皮提取制備的肽具有成為新型功能食品的潛力。

我國(guó)是鱘魚養(yǎng)殖大國(guó)，年產(chǎn)量逐年遞增，鱘魚的出口、銷售主要以魚子醬、魚肉產(chǎn)品加工為主，大量鱘魚皮被作為加工下腳料直接丟棄或作為飼料，其優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未被開發(fā)利用。同時(shí)，目前對(duì)鱘魚皮來(lái)源的DPP-IV抑制活性肽報(bào)道較少。因此，本研究首先探究酶法制備鱘魚皮DPP-IV抑制肽的最適酶解條件，進(jìn)一步分離純化并鑒定鱘魚皮膠原蛋白水解物中DPP-IV抑制肽，以期為鱘魚皮膠原蛋白作為功能性原料的商業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚 北京十渡鱘魚繁殖基地。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶 寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；DPP-IV抑制劑篩選試劑盒、福林-酚乙液 美國(guó)Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、牛血清蛋白、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-亮氨酸、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、鹽酸 北京化工廠；乙腈（色譜純）、三氟乙酸（色譜純）、葡聚糖凝膠Sephadex G15瑞典Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；凝膠層析柱 北京拜爾迪有限公司；中空纖維超濾膜組件、超濾膜 北京旭邦膜設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；高分辨率質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚皮明膠液的制備

將鱘魚皮洗凈除雜，切成小塊后用4.8 mol/L鹽酸溶液浸泡2 h，經(jīng)過(guò)酸膨脹的膠原組織就變得十分柔軟，可以直接用于提取明膠。蒸餾水沖洗魚皮至弱酸性后高壓浸提（121 ℃，2 h），去除魚皮、油脂等雜質(zhì)，得到明膠液冷凍干燥成干粉備用。

1.3.2 最優(yōu)酶解條件的確定

1.3.2.1 蛋白酶的選擇

蛋白酶活力測(cè)定：根據(jù)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》，采用福林-酚法測(cè)定蛋白酶活力。

采用5 種蛋白酶（中性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶）分別在其最適的pH值及溫度條件下（堿性蛋白酶溫度55 ℃、pH 8.0；中性蛋白酶45 ℃、pH 7.0；木瓜蛋白酶50 ℃、pH 7.0；胰蛋白酶45 ℃、pH 8.0；胃蛋白酶50 ℃、pH 2.0），酶底比（酶活力-明膠粉質(zhì)量比）為105U/g，料液比（明膠粉質(zhì)量-溶液體積比）為1∶10（g/mL），酶解4 h后沸水浴滅酶10 min，真空抽濾，以DPP-IV抑制率、肽得率及水解度3 種指標(biāo)綜合考慮選擇最適的蛋白酶。

1.3.2.2 酶解條件單因素試驗(yàn)

首先在料液比1∶10（g/mL）、所選最適酶加酶量105U/g、酶解溫度50 ℃，酶解pH值分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的條件下酶解4 h，篩選最適的酶解pH值；各組酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，其余條件一致，篩選最適的酶解溫度；各組加酶量分別為103、104、105、106、107U/g，其余條件一致，篩選最適的加酶量；各組分別酶解3、6、9、12、15、18 h，其余條件一致，篩選最適的酶解時(shí)間；各組料液比分別為1∶100、1∶50、1∶25、3∶50、2∶25、1∶10（g/mL），其余條件一致，篩選最適的料液比。

1.3.2.3 PB試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)（N=12），響應(yīng)值為酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率。通過(guò)對(duì)各因素效應(yīng)值、方差和貢獻(xiàn)率的分析，篩選出最重要的3 個(gè)影響因素進(jìn)行下一步研究。

1.3.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)得到的顯著因素及效應(yīng)值，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的方向及步長(zhǎng)。所選擇影響因素的正負(fù)效應(yīng)值分別對(duì)應(yīng)增加或減少，步長(zhǎng)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定；非顯著因素的取值依據(jù)PB試驗(yàn)效應(yīng)值確定。

1.3.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

由最陡爬坡試驗(yàn)得到的拐點(diǎn)可確定響應(yīng)中心點(diǎn)及接近響應(yīng)值區(qū)域因素的取值范圍，采用Box-Behnken法，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。模型對(duì)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到等高線及響應(yīng)面圖，獲得最優(yōu)酶解條件，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，確定可信度，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3.3 DPP-IV抑制肽的分離純化

1.3.3.1 超濾

利用分子質(zhì)量為10、5 kDa及3 kDa的超濾膜依次對(duì)鱘魚皮膠原蛋白酶酶解液進(jìn)行純化，得到4 個(gè)分子質(zhì)量不同的組分，分別是F-I：＞10 kDa；F-II：5～10 kDa；F-III：3～5 kDa；F-IV：＜3 kDa。收集各組分并凍干以評(píng)價(jià)各組DPP-IV抑制活性，并進(jìn)一步分離純化。

1.3.3.2 凝膠過(guò)濾層析分離

利用凝膠過(guò)濾層析法對(duì)F-IV組分進(jìn)一步純化[19]。分離條件：洗脫液為去離子水，流速2.5 mL/min，依據(jù)在280 nm波長(zhǎng)處觀測(cè)洗脫曲線上的峰，于9 min后開始收集每個(gè)組分，將收集到的每個(gè)組分冷凍干燥并評(píng)估DPP-IV抑制活性。

1.3.3.3 RP-HPLC分離

采用RP-HPLC對(duì)SP1組分進(jìn)行第3步純化[20]。分離條件：色譜柱Kromasil 100-5-C18；流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸的超純水；流動(dòng)相B為含0.1%三氟乙酸的乙腈；進(jìn)樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL；進(jìn)樣量為50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。洗脫程序：0～5 min，100% A、0% B；5～10 min，100%～80% A、0%～20% B；10～45 min，80%～55% A、20%～45% B；45～65 min，55%～80% A、45%～20% B。利用自動(dòng)餾分收集器收集各洗脫峰的餾分，然后凍干并測(cè)定不同組分的DPP-IV活性。

1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

利用LC-MS/MS對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行分析鑒定[21]。色譜條件：流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水；流動(dòng)相B為含0.1%甲酸及19.9%超純水的乙腈；流速0.3 μL/min；洗脫程序：0～120 min，62% A、3%～38% B。使用高靈敏度模式，每個(gè)全掃描為高速信號(hào)依賴掃描，掃描時(shí)間120 min。一級(jí)全掃描分辨率70 000，掃描范圍為m/z350～1 800，離子容量為3×106，最大注射時(shí)間為20 ms；每一個(gè)一級(jí)掃描后篩選前20 個(gè)離子進(jìn)入碰撞池打碎，碰撞能量為32%，二級(jí)掃描分辨率17 500，電荷狀態(tài)篩選（包含＋2～＋6電荷的前體），動(dòng)態(tài)消除60 s。從質(zhì)譜鑒定分析得到的肽段氨基酸序列中篩選出6 條符合DPP-IV抑制活性特征的多肽送往生物公司合成，分別測(cè)定其DPP-IV抑制活性并置于－20 ℃冰箱保存。

1.3.5 鱘魚皮膠原蛋白酶解物肽得率的測(cè)定

TCA作為一種蛋白質(zhì)沉淀劑可以沉淀蛋白質(zhì)以及較長(zhǎng)的肽段。會(huì)被TCA沉淀的肽段含有的最少氨基酸殘基數(shù)與其底物有關(guān)，TCA氮溶解指數(shù)就特定的底物而言可以定性反映蛋白質(zhì)的分裂情況。因此，采用TCA沉淀法[22]與福林-酚法[23]結(jié)合法測(cè)定鱘魚皮酶解肽的肽得率情況。

取明膠或膠原蛋白肽樣品5 mL，加入5 mL 30% TCA溶液混勻后靜置20 min，4 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液稀釋到一定倍數(shù)。加入5 mL福林-酚甲液并混勻，置于25 ℃保溫10 min，加入0.5 mL福林-酚乙液后立即振蕩混勻，在25 ℃保溫30 min，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品多肽含量。

將測(cè)得的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，通過(guò)下式計(jì)算酶解液肽得率：

式中：N2為蛋白酶解液中30% TCA可溶性蛋白量/mg；N1為反應(yīng)前蛋白液中30% TCA可溶性蛋白量/mg；N0為總蛋白量/mg。

1.3.6 鱘魚皮膠原蛋白酶解物DPP-IV抑制率的測(cè)定

取酶解后膠原蛋白酶解液，為避免酸性或堿性環(huán)境對(duì)DPP-IV活性的影響，將各組酶解液pH值統(tǒng)一調(diào)節(jié)為7.0，冷凍干燥后定量用DPP-IV抑制劑篩選試劑盒測(cè)定酶解物DPP-IV抑制活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜蛋白酶的選擇

以DPP-IV抑制率為指標(biāo)，依據(jù)1.3.6節(jié)方法在相同加酶量、料液比、酶解時(shí)間和各酶的最適溫度和pH值的條件下，考察不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV抑制率的影響。如圖1所示，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高，且與其他蛋白酶酶解產(chǎn)物有顯著差異（P＜0.05），因此選擇木瓜蛋白酶制備DPP-IV抑制活性肽可以獲取活性更強(qiáng)的目的產(chǎn)物。

圖1 不同蛋白酶解液的DPP-IV抑制率Fig. 1 Percentage of DPP-IV by hydrolysates prepared with different proteases

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，當(dāng)pH 2.0時(shí)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率很低，但當(dāng)pH值增長(zhǎng)到4.0時(shí)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率顯著增長(zhǎng)，達(dá)到80.27%。pH值為6.0時(shí)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率達(dá)到最大值88.57%（圖2A），且pH值為6.0與pH值為2.0、8.0、10.0三種條件的酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率有顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率有最大值（圖2B），因此選擇45 ℃為木瓜蛋白酶最適宜制備DPP-IV抑制活性肽酶解溫度；如圖2C所示，酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率隨著加酶量增加先升高后降低。這與Nongonierma等[24]采用酶解法制備DPP-IV抑制肽的結(jié)論類似，在加酶量較少時(shí)酶添加量與DPP-IV抑制效果呈正相關(guān)關(guān)系，且在加酶量為105U/g時(shí)達(dá)到最大值87.98%，此時(shí)酶分子相對(duì)底物已趨近飽和，繼續(xù)增大加酶量會(huì)導(dǎo)致具有DPP-IV抑制活性的多肽分子在酶的作用下減少，DPP-IV抑制率逐漸降低；酶解時(shí)間結(jié)果顯示（圖2D），酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率由3 h的86.10%，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)到15 h的最大值91.29%，之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率呈下降趨勢(shì)。Lacroix等[25]利用胃蛋白酶酶解乳清分離蛋白制備DPP-IV抑制肽時(shí)，DPP-IV抑制活性隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)同樣呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢(shì)。這是由于啟動(dòng)酶解反應(yīng)后隨著時(shí)間延長(zhǎng)蛋白質(zhì)水解生成的DPP-IV抑制肽含量增多，當(dāng)達(dá)到最大值后，蛋白質(zhì)水解成的肽被進(jìn)一步水解成氨基酸，抑制肽含量隨之減少；圖2E結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶50、1∶25、2∶25、1∶10（g/mL）時(shí)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率均不存在顯著差異（P＞0.05），料液比為3∶50（g/mL）時(shí)該指標(biāo)取得最大值91.71%。通過(guò)單因素試驗(yàn)得到的最適酶解條件為pH 6.0、酶解溫度45 ℃、加酶量105U/g、酶解時(shí)間15 h、料液比3∶50（g/mL）。

圖2 pH值（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）、酶解時(shí)間（D）、料液比（E）對(duì)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率的影響Fig. 2 Effects of pH (A), temperature (B), enzyme dosage (C),time (D), and solid-to-liquid ratio (E) on percentage of DPP-IV inhibition by hydrolysates

2.3 PB試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)pH值、酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間、料液比5 個(gè)因素進(jìn)行分析，考察各因素對(duì)制備DPP-IV抑制活性肽的影響，用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)N=12的PB試驗(yàn)，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)中各影響因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適取值范圍，確定高低水平，以酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman design and experimental response

用Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析以及方差分析，結(jié)果如表2、3所示。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及效應(yīng)分析Table 2 Effect analysis of each variable used in Plackett-Burman design

表3 PB試驗(yàn)整體因素模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the effect of all variables tested in Plackett-Burman design on response

由表2可看出，pH值、酶解溫度和加酶量3 個(gè)因素對(duì)制備DPP-IV抑制活性肽顯示為正效應(yīng)，酶解時(shí)間和料液比顯示為負(fù)效應(yīng)。各因素效應(yīng)值大小及貢獻(xiàn)率體現(xiàn)出該因素對(duì)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率的影響程度，效應(yīng)值的絕對(duì)值越大代表該因素貢獻(xiàn)率越高，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。

對(duì)12 組試驗(yàn)結(jié)果建模分析得到表3，可看出整體模型方差P值為0.048 8，P＜0.05，表明模型整體對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。通過(guò)各因素P值可看出該因素對(duì)酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率影響的顯著性，而且P值與因素的貢獻(xiàn)率有關(guān)，P值越小代表貢獻(xiàn)率越高，選擇pH值、加酶量、酶解時(shí)間3 個(gè)影響最顯著的因素。因此部分模型選擇三因素以進(jìn)行方差分析，如表4所示。

表4 PB試驗(yàn)部分因素模型方差分析Table 4 Analysis of variance of the effect of selected variables tested in Plackett-Burman design on response

由表4可得出，該模型的F值為25.52，該值由噪聲引起的可能性僅有0.02%，表明該模型顯著。pH值、加酶量、酶解時(shí)間均為極顯著因素，因此以這3 個(gè)因素建立模型對(duì)制備DPP-IV抑制活性肽的酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化。其余因素將PB試驗(yàn)的正負(fù)效應(yīng)與單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合確定因素水平，分別為酶解溫度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

模型考察的區(qū)域越接近最佳值區(qū)域，則響應(yīng)面擬合方程越有效。最陡爬坡法將各因素正負(fù)效應(yīng)的變化確定為爬坡方向，利用各因素的效應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng)，可以更經(jīng)濟(jì)快速地逼近最佳值區(qū)域。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要影響因素的最陡爬坡路徑，其中pH值和加酶量為正效應(yīng)，應(yīng)增加，酶解時(shí)間為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。按照因素水平的變化步長(zhǎng)及方向設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。最佳酶解條件可能在試驗(yàn)2和試驗(yàn)4之間，因此以試驗(yàn)3的條件（酶解溫度50 ℃、料液比1∶100（g/mL）、pH 6.0、加酶量104U/g、酶解時(shí)間12 h）為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Steepest ascent design and experimental response

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn)，以酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表6所示。

表6Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and experimental response

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，如表7所示。

表7Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model obtained from Box-Behnken design

表8Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型的可信度分析Table 8 Reliability analysis of regression model obtained from Box-Behnken design

由表7可得，該模型的F值為59.87，表明模型F值由噪聲引起的可能性僅為0.01%，即模型回歸極顯著。模型失擬項(xiàng)P值為0.161 3＞0.05，失擬檢驗(yàn)不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小。該模型R2為0.985 1，表示該模型擬合較好。由表8可知，模型信噪比為21.975，大于4.0，表明上述模型合理、可用。以上分析結(jié)果說(shuō)明模型選擇適當(dāng)。利用Design-Expert軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行二次多元回歸擬合處理，取得酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率（Y）對(duì)pH值（A）、加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）的二次多元回歸方程為：

Y=90.89－3.09A＋14.21B＋2.39C＋5.08AB＋0.53AC－3.32BC－1.07A2－19.79B2－0.37C2

根據(jù)上述二次多元回歸擬合方程及回歸模型方差分析可得到二次回歸方程等高線圖和響應(yīng)面圖（圖3）?？芍?，二次項(xiàng)系數(shù)為－18.94，表明方程具有最大值。得到的等高線圖呈橢圓形，拋物線向下，說(shuō)明模型存在最大值，模型建立良好。軟件得到的酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高的方案為pH 6.12、加酶量10 170.35 U/g、酶解時(shí)間12.12 h，此條件下預(yù)測(cè)的DPP-IV抑制率為95.31%。依據(jù)此酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到酶解產(chǎn)物DPP- IV抑制率為94.92%，與模型預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

進(jìn)一步檢測(cè)在此酶解條件下肽得率，結(jié)果顯示酶解產(chǎn)物肽得率由優(yōu)化前的1.34%增長(zhǎng)到2.08%，肽得率同比增長(zhǎng)了55.22%。

圖3 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effect of variables on response

2.6 鱘魚皮膠原蛋白水解物的超濾分離

根據(jù)木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布，通過(guò)10、5 kDa和3 kDa三種超濾膜分離產(chǎn)生了F-I（＞10 kDa）、F-II（5～10 kDa）、F-III（3～5 kDa）、F-IV（＜3 kDa）4 個(gè)組分，評(píng)價(jià)不同組分的DPP-IV抑制能力（圖4）?？芍?，F(xiàn)-IV（＜3 kDa）具有比其余3 個(gè)組分更高的DPP-IV抑制活性。因此選擇鱘魚皮酶解產(chǎn)物中＜3 kDa組分進(jìn)行下一階段的純化。

圖4 鱘魚皮酶解物超濾各組分的DPP-IV抑制率Fig. 4 Percentage of DPP-IV inhibition by ultrafiltration fractions

2.7 鱘魚皮膠原蛋白肽的凝膠層析分離純化

圖5 分子質(zhì)量低于3 kDa的組分280 nm處凝膠層析圖譜（A）和凝膠層析各組分DPP-IV抑制率（B）Fig. 5 Gel permeation chromatographic profiles at 280 nm of fractions with molecular mass below 3 kDa (A) and percentage of inhibition of DPP-IV by the fractions (B)

根據(jù)通過(guò)電腦紫外檢測(cè)儀檢測(cè)所得吸收峰隨時(shí)間的變化情況（圖5A），對(duì)凝膠層析分離后的3 個(gè)組分進(jìn)行收集并檢測(cè)其DPP-IV抑制活性，結(jié)果如圖5B所示。組分SP1顯示出比另外兩個(gè)組分更高的DPP-IV抑制活性，且存在顯著差異，在5 mg/mL質(zhì)量濃度下抑制率達(dá)（77.69±1.02）%。張弛[26]利用凝膠柱分離鳙魚魚肉蛋白肽發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量最小的組分顯示出比其他2 個(gè)組分更高的DPP-IV抑制活性。吉薇[27]以南極磷蝦為原料提取DPP-IV抑制活性肽時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量最小的組分具有最強(qiáng)的DPP-IV抑制活性。以上均與本研究結(jié)果類似，因此收集組分SP1并凍干進(jìn)行后續(xù)RP-HPLC純化。

2.8 鱘魚皮膠原蛋白肽的RP-HPLC分離純化

將組分SP1質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL后上樣RPHPLC，根據(jù)色譜圖中出峰時(shí)間和峰形收集到19 個(gè)組分，如圖6A所示，檢測(cè)各組分DPP-IV抑制能力。由圖6B可知，收集到的19 個(gè)組分中組分4的DPP-IV抑制活性最強(qiáng)，且與其余各組存在顯著差異。因此收集組分4用于進(jìn)一步分析肽序列。

圖6 凝膠層析組分SP1的RP-HPLC（A）和RP-HPLC組分DPP-IV抑制活性（B）Fig. 6 RP-HPLC chromatogram of SP1 (A) and percentage of DPP-IV inhibition by sub-fractions separated from SP1 (B)

2.9 質(zhì)譜鑒定分析及合成多肽DPP-IV抑制活性

圖7 多肽的DPP-IV抑制活性分析Fig. 7 Analysis of DPP-IV inhibitory activity of synthetic peptides

利用LC-MS/MS從組分4中分析鑒定出10 條多肽。研究表明疏水性氨基酸對(duì)多肽的DPP-IV抑制活性有促進(jìn)作用，除此之外，多肽在N末端第1、2、3、4個(gè)氨基酸殘基處及倒數(shù)第2位為P的多肽具有良好的DPP-IV抑制活性[28]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在C末端倒數(shù)第1個(gè)和倒數(shù)第2個(gè)氨基酸殘基處含P的多肽也具有較好的DPP-IV抑制活性[29]。所以，實(shí)驗(yàn)根據(jù)鑒定出的10 條肽豐度和潛在的DPP-IV抑制性質(zhì)，選擇其中的6 個(gè)肽進(jìn)行合成（純度為98%以上），對(duì)應(yīng)DPP-IV抑制率如圖7所示。在質(zhì)量濃度為1 mg/mL條件下多肽GPSGLDGAK表現(xiàn)出的DPP-IV抑制活性最強(qiáng)且存在顯著差異，DPP-IV抑制率達(dá)到（65.43±1.59）%，利用對(duì)數(shù)回歸分析確定該多肽的IC50值為（61.27±1.16）μmol/L。

上述DPP-IV抑制活性最高的GPSGLDGAK多肽序列正符合之前研究所得出的結(jié)論，N末端第2位含有P或A及某些特定的氨基酸如I和L的多肽具有較高的體外DPP-IV抑制活性[30-31]。羊乳蛋白源[32]的DPP-IV抑制肽MHQPPQPL的IC50值為（350.41±4.1）μmol/L，SPTVMFPPQSVL的IC50值為（676.31±12.6）μmol/L，牛乳蛋白源的YPVEPF的IC50值為（196.67±4.5）μmol/L，鳙魚魚肉源的多肽LPIIDI的IC50值為（105.44±3.11）μmol/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該多肽與陽(yáng)性對(duì)照相比IC50值較高，二普羅汀A（Diprotin A）的IC50為（5.48±0.75）μmol/L，表明GPSGLDGAK的DPP-IV抑制活性相比Diprotin A略低。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化出木瓜蛋白酶酶解膠原蛋白的最佳酶解條件為pH 6.12、加酶量10 170.35 U/g、酶解時(shí)間12.12 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶100（g/mL），此條件下酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制率達(dá)到94.92%，較優(yōu)化前增長(zhǎng)了57.41%。同時(shí)對(duì)鱘魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物利用超濾、凝膠層析及RP-HPLC分離純化后利用LC-MS/MS對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步的DPP-IV抑制活性結(jié)果顯示，GPSGLDGAK的DPP-IV抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為（61.27±1.16）μmol/L。本研究為鱘魚皮的生物活性研究提供了新思路，也為利用水產(chǎn)加工下腳料開發(fā)多肽產(chǎn)品提供了理論依據(jù)和科學(xué)參考。