芬頓氧化體系處理對白斑狗魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

鄧小蓉，雷用東，劉 娟，盧士玲，張 建

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

白斑狗魚（Esox lucius），俗稱北梭魚，是一種適應(yīng)性強、生長速度快，體型大且壽命長的魚類，廣泛分布于北美、歐洲和亞洲的湖泊、河流和半咸水的沿海水系，對休閑游釣和商業(yè)捕魚非常重要[1]。在中國，白斑狗魚主要產(chǎn)于新疆阿勒泰地區(qū)的額爾齊斯河流域、烏倫古湖及附屬水體，因其具有肉味鮮美、營養(yǎng)價值高、無肌間刺、養(yǎng)殖潛力大等特點而備受青睞，已被列為新疆水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要土著魚之一[2]。

在加工和貯藏過程中發(fā)生的蛋白氧化是影響肉類品質(zhì)的重要因素之一[3]。羰基的形成和巰基的減少會進一步破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性[4-5]。肌肉蛋白，特別是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP），易受活性氧的影響[6-7]。引起肉蛋白質(zhì)氧化損傷的最主要和最有效的活性氧是羥自由基，羥自由基可以通過芬頓反應(yīng)，由鐵離子催化過氧化氫（H2O2）和細胞還原劑產(chǎn)生[8]。芬頓氧化系統(tǒng)（Fe3＋、抗壞血酸和不同濃度H2O2）誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化已在食品系統(tǒng)中進行了廣泛研究[9-10]。

蛋白的氧化修飾常導(dǎo)致其理化性質(zhì)變化，從而改變其功能，這些修飾可以參與鮮肉品質(zhì)的調(diào)控，影響肉制品的加工性能[11-12]。然而，蛋白質(zhì)氧化并不總是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的損害。一般來說，過度氧化的蛋白消化率較低，部分原因是蛋白聚集，而輕度氧化蛋白容易被相應(yīng)的蛋白酶消化[13]。此外，Lu Han等[14]報道顯示，一定程度的冷凍貯藏和羥自由基引起的輕度蛋白氧化，可以促進鳙魚MP的凝膠結(jié)構(gòu)和保水能力。Srinivasan等[15]報道，鱈魚肉糜暴露于羥自由基生成系統(tǒng)中后表現(xiàn)出更好的凝膠化和乳化特性。Zhang Longteng等[16]的研究結(jié)果也表明，輕度氧化修飾（0.1～1 mmol/L H2O2）有利于凝膠形成能力的增強，而強氧化環(huán)境（5～10 mmol/L H2O2）則表現(xiàn)為凝膠強度減弱，結(jié)構(gòu)性能降低。

白斑狗魚肌肉蛋白易受自由基的破壞，在加工和貯藏過程中造成產(chǎn)品質(zhì)量下降，并可能導(dǎo)致蛋白功能特性的改變。因此，測定不同氧化程度下蛋白質(zhì)功能的變化，有助于進一步了解白斑狗魚貯存或加工過程中的氧化修飾。鑒于此，本實驗以白斑狗魚MP為研究對象，采用羥自由基生成系統(tǒng)體外模擬氧化，研究不同氧化程度對MP結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，這些結(jié)果將對闡明氧化對白斑狗魚肌肉蛋白質(zhì)量的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白斑狗魚（質(zhì)量約1.5 kg）購于新疆石河子當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場；去鱗、去內(nèi)臟、流水沖洗干凈，取魚背部肌肉并切成均勻塊狀（質(zhì)量約15 g），置于冰箱（－20 ℃）中備用。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；熒光分光光度計 美國Cary公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transformed infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國Thermo Fisher公司；Mini-protein III凝膠電泳儀、ChemiDoc MP凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Deng Xiaorong等[17]的方法，取一定魚背部肌肉，加入10 倍體積磷酸鹽緩沖液A（50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.5 ），均質(zhì)1 min，于4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液A再提取一次。向沉淀中加入10 倍體積磷酸鹽緩沖液B（50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4、0.6 mol/L NaCl，pH 7.5），均質(zhì)1 min，于4 ℃、8 000×g離心15 min，收集上清液，即為所需MP。采用雙縮脲法[18]測定蛋白質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0253 6x＋0.001 72，R2=0.999 57。所得MP溶液存放于－80 ℃冰箱，備用。

1.3.2 MP的氧化

參照Park等[19]的方法制備羥自由基生成系統(tǒng)。將提取的蛋白樣品分別溶解在羥自由基生成系統(tǒng)的50 mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液（含0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸、1～20 mmol/L H2O2）中，于4 ℃條件下分別氧化1、3、5 h，然后加入1 mmol/L乙二胺四乙酸以終止氧化。以未氧化MP為對照。

1.3.3 羰基含量的測定

采用2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）法測定MPs的羰基含量，評估蛋白氧化程度。用磷酸鹽緩沖溶液B將MP溶液稀釋至2 mg/mL，將1 mL稀釋的MP溶液加入到1 mL 10 mmol/L DNPH溶液（用2 mol/L HCl溶液配制）中，室溫下暗處靜置1 h，每15 min攪拌一次。加入20 g/100 mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，8 000×g離心20 min，然后用乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗滌3 次。所得沉淀溶于3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中。以2 mol/L HCl溶液為對照，于370 nm波長處測定蛋白溶液吸光度。羰基含量以每毫克蛋白所含羰基物質(zhì)的量表示，單位為nmol/mg，摩爾吸光系數(shù)為22 000 L/（mol?cm）[18]。

1.3.4 溶解度的測定

參照Wang Jingyu等[20]的方法并稍作修改。取5 mL 5 mg/mL MP溶液，于4 ℃、8 000×g離心20 min。收集上清液，用雙縮脲測定蛋白質(zhì)量濃度，計算上清液蛋白質(zhì)量濃度與總蛋白質(zhì)量濃度的比值，作為MP溶解度。

1.3.5 濁度的測定

參考Xia Xiufang等[21]的方法，取5 mL 1 mg/mL MP溶液（用磷酸鹽緩沖液B配制）分別于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中加熱30 min。冷卻靜置1 h后，測定600 nm波長處溶液吸光度。濁度以A600nm表示。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

分別使用5%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE分析。每個泳道中裝入10 μL 1 mg/mL樣品溶液，濃縮膠和分離膠的電壓分別為70 V和110 V。電泳后用考馬斯亮藍染色，脫色后使用凝膠成像儀掃描成像。

1.3.7 FTIR分析

參照Kang Dacheng等[22]的方法進行樣品預(yù)處理。將1 mg凍干蛋白樣品與100 mg KBr混合研磨并壓成小片。用FTIR儀在室溫下掃描，掃描范圍400～4 000 cm－1。用Peak fit 4.0軟件采用高斯峰擬合算法分析MP二級結(jié)構(gòu)。

1.3.8 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

參照Motoi等[23]的方法。將10 mL 5 mg/mL的MP溶液（V0）放入50 mL塑料量筒中，在25 ℃條件下1 800 r/min攪拌1 min，立即讀取泡沫體積，記為V1/mL。靜置1 h后測量量筒內(nèi)泡沫體積，記為Vt/mL。起泡性（Fc）和泡沫穩(wěn)定性（Fs）分別按式（1）、（2）計算：

1.3.9 乳化性能的測定

采用Pearce等[24]的方法，將純大豆油和5 mg/mL MP溶液按體積比1∶4加入50 mL離心管中，混合均勻。分別在第0分鐘和第10分鐘時取管底部0.5 cm處乳液50 μL，并分散到5 mL 0.1% SDS溶液中，在500 nm波長處測定乳液吸光度，以0.1% SDS溶液作為空白。乳化性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）分別按式（3）、（4）計算：

式中：ρ為MP質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數(shù)（20%）；L為比色杯光程（1 cm）；A1和A2分別表示第0分鐘和第10分鐘時乳液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件進行分析，所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以表示，個體均值之間的差異采用Duncan多重檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化對白斑狗魚MP羰基含量的影響

圖1 氧化后MP羰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl group content of MP after oxidation

蛋白氧化可將一些氨基酸殘基轉(zhuǎn)換成羰基衍生物，羰基水平已被廣泛用作蛋白氧化損傷的標(biāo)志[25]。如圖1所示，與對照組相比，MP羰基含量隨著氧化程度的增加顯著增加（P＜0.05）。在不同H2O2濃度下氧化5 h后，羰基含量較對照組分別增加了15.92%、25.84%、29.33%、31.42%和34.50%。H2O2濃度為1～15 mmol/L，在氧化處理0～3 h內(nèi)，MP羰基含量顯著增加（P＜0.05）；隨著氧化時間進一步延長（3～5 h），羰基含量略有增加，差異不顯著（P＞0.05）。羰基含量是蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)之一。MP羰基含量的增加可歸因于某些氨基酸殘基向羰基衍生物的轉(zhuǎn)化，或氧化誘導(dǎo)的肽斷裂[26]。有研究表明，隨著羰基含量增加，蛋白質(zhì)對熱聚集的敏感性增加，從而導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)和流變性能改變[27]。Li Yanqing等[28]也報道MP結(jié)構(gòu)和功能隨氧化程度的增加而發(fā)生改變。

2.2 氧化對白斑狗魚MP聚集性的影響

2.2.1 MP溶解度的變化

圖2 氧化后MP溶解度的變化Fig. 2 Changes in protein solubility index of MP after oxidation

溶解度是測定蛋白變性和聚集最實用的方法，是衡量蛋白質(zhì)功能的一個很好的指標(biāo)[29]。由圖2可知，氧化處理后白斑狗魚MP溶解度顯著降低（P＜0.05），在雞肉[30]和豬肉MP[31]中也報道了類似結(jié)果。相同氧化時間下，MP溶解度隨H2O2濃度的增加顯著降低（P＜0.05），在低濃度氧化條件下（1～5 mmol/L H2O2），溶解度下降幅度相對較小；隨著氧化劑濃度的進一步增加（10～20 mmol/L H2O2），溶解度下降明顯，在20 mmol/L H2O2、氧化5 h處理后，MP溶解度與對照組相比下降了72.19%。氧化處理后MP溶解度的降低可能是由于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化形成了不溶性聚集體，氧化程度越高，溶解度越低，這可能是由于高氧化程度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和沉淀，從而導(dǎo)致溶解度降低[32,33]。

2.2.2 MP濁度的變化

表1 氧化3 h后MP濁度的變化Table 1 Changes in MP turbidity after 3 h oxidation

濁度水平變化用于監(jiān)測白斑狗魚MP的聚集，MP聚集體的形成會導(dǎo)致溶液光密度的增加[28]。如表1所示，隨著氧化水平的增加和溫度的升高，MP濁度出現(xiàn)不同程度增加。不同溫度下，MP在低濃度氧化條件下（1～5 mmol/L H2O2）的濁度變化程度相對較小，高濃度氧化條件下（10～20 mmol/L H2O2），MP濁度變化明顯。隨著溫度的升高，特別是大于50 ℃條件下，MP濁度增加程度隨著H2O2濃度增加而增加。結(jié)果表明，較高的氧化程度促使蛋白產(chǎn)生更多的聚集，這與3 種不同氧化體系（FeCl3、CuSO4或馬骨骼肌肌紅蛋白與2.5 mmol/L H2O2組合）氧化豬背長肌MP蛋白的結(jié)果相似[9]。Parkington等[34]也報道了類似結(jié)果，隨蛋白羰基含量的增加，牛心肌肉糜中肌球蛋白聚集增加。許多功能特性受到不同蛋白之間相互作用的影響，因此，過度氧化導(dǎo)致的蛋白聚集可能會對肉類食品品質(zhì)產(chǎn)生負面影響[35]。

2.3 氧化對白斑狗魚MP構(gòu)象的影響

2.3.1 SDS-PAGE分析

圖3 氧化3 h后MP的非還原和還原SDS-PAGE圖Fig. 3 Non-reduced and reduced SDS-PAGE patterns of MP after 3 h oxidation

對不同H2O2濃度、氧化3 h的MP進行非還原（添加β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME））和還原（不添加β-ME）進行SDS-PAGE分析，觀察由氧化引起的蛋白質(zhì)之間的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)。如圖3所示，清晰可見具有高強度的肌球蛋白重鏈（＞200 kDa）和肌動蛋白（45 kDa）條帶，以及其他一些相對較低強度的蛋白條帶。還原SDS-PAGE圖顯示，氧化組和對照組的所有條帶強度都沒有明顯差異，然而非還原SDS-PAGE圖顯示，肌球蛋白重鏈1的條帶強度變淺，特別是H2O2濃度為10 mmol/L和20 mmol/L時，此條帶基本消失。肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白、肌球蛋白重鏈7、肌動蛋白、條帶1和條帶2也觀察到了類似結(jié)果。此外，還觀察到非還原SDS-PAGE圖頂部有一些蛋白質(zhì)聚集。肌球蛋白是MP中最豐富的蛋白質(zhì)，易受活性氧的影響，包括脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)氫過氧化物、鐵或銅/抗壞血酸/H2O2和肌紅蛋白/H2O2，當(dāng)受到氧化時，肌球蛋白會形成大的不溶性聚集體[36]。也有報道指出，由于羥自由基氧化，肌球蛋白灰度值降低[37-38]。羥自由基通過二硫鍵或其他相互作用引起蛋白交聯(lián)，當(dāng)H2O2濃度較高時，交聯(lián)更明顯[14]。結(jié)果表明，羥自由基氧化誘導(dǎo)了MP的二硫鍵交聯(lián)，并形成了蛋白聚集體。

2.3.2 FTIR圖譜分析

圖4 氧化3 h后MP的FTIR圖譜Fig. 4 FTIR spectra of MP after 3 h oxidation

如圖4所示，與對照組相比，1 mmol/L H2O2氧化處理3 h使MP的FTIR各峰上移，H2O2濃度增加到10 mmol/L，圖譜中各峰幾乎與對照組重合，而H2O2濃度20 mmol/L MP的各峰下移。所有樣品在3 300 cm－1附近均顯示出一條寬而強的譜帶，此譜帶與酰胺A的—NH—和—OH拉伸振動有關(guān)；經(jīng)不同濃度H2O2處理后該峰從3 300.47 cm－1分別略微左移至3 302.33（1 mmol/L）、3 302.78 cm－1（10 mmol/L）和3 393.24 cm－1（20 mmol/L）處，表明過度氧化引起MP中的分子間作用力發(fā)生變化[39]。1 655.42 cm－1和1 540.55 cm－1處的2 個峰為典型的蛋白譜帶，分別與酰胺I帶（—CO—拉伸和—CN拉伸）和酰胺II帶（—NH彎曲、—CN拉伸和C=C拉伸）有關(guān)[40]。氧化后隨著H2O2濃度增加，2 個峰均向較低波數(shù)處移動，這可能是由于包括NH2在內(nèi)的功能性官能團的丟失[41]。

表2 氧化3 h后MP二級結(jié)構(gòu)的變化Table 2 Secondary structure changes in MP after 3 h oxidation

由于酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）主要是基于酰胺基的—CO—伸縮振動（約80%），因此可用于測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[42]。如表2所示，H2O2濃度0～10 mmol/L，隨著H2O2濃度的增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量逐漸減少，無規(guī)卷曲則相對含量在1 mmol/L時達到最大后下降。一般來說，α-螺旋結(jié)構(gòu)由肽鏈內(nèi)的氫鍵穩(wěn)定，而β-折疊結(jié)構(gòu)依賴于肽鏈間的氫鍵[43]，β-轉(zhuǎn)角歸因于高度有序結(jié)構(gòu)，而無規(guī)卷曲主要來自高階結(jié)構(gòu)的展開和相關(guān)蛋白的靈活性[44-45]。這些結(jié)果表明，羥自由基氧化導(dǎo)致部分有序結(jié)構(gòu)（如β-轉(zhuǎn)角）向α-螺旋轉(zhuǎn)變，表明分子間作用力減弱，同時β-折疊相對含量的減少可能是由于蛋白-蛋白相互作用的減少導(dǎo)致分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的破壞[46-47]。當(dāng)氧化劑濃度進一步增加至20 mmol/L，與H2O2濃度10 mmol/L相比，α-螺旋相對含量顯著減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加（P＜0.05），表明α-螺旋展開，形成β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。Sun Weizheng等[48]報道，經(jīng)氧化劑處理后，豬肌肉蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋減少，β-折疊結(jié)構(gòu)增加；Liu Qian等[49]發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白經(jīng)羥自由基氧化修飾后α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少，β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。這些結(jié)果與本實驗結(jié)果有所不同，可能是由于蛋白來源不同。

2.4 氧化對白斑狗魚MP功能特性的影響

2.4.1 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的變化

如圖5A所示，與對照組相比，氧化可顯著增加MP的起泡性（P＜0.05），特別是在中度氧化（5、10 mmol/L H2O2）條件下，MP起泡性最佳，且隨著氧化時間的延長起泡性增強（P＜0.05）。隨著H2O2濃度的進一步增加，MP的起泡性又有所降低，但氧化MP的起泡性仍高于對照組。MP泡沫穩(wěn)定性變化程度較?。▓D5B），特別是在1～10 mmol/L H2O2氧化后，泡沫穩(wěn)定性仍能保持在88%以上。Kong Baohua等[50]在乳清分離蛋白的起泡性研究中也得到類似結(jié)果，5 mmol/L H2O2氧化5 h，乳清分離蛋白起泡活性較未氧化時顯著改善（P＜0.05）。Li Junsheng等[51]也報道適度氧化可以增加大豆分離蛋白的起泡能力，但是過度氧化會降低起泡能力，但對泡沫穩(wěn)定性沒有顯著影響。結(jié)果表明，氧化可提高MP的起泡能力，而過度氧化（15、20 mmol/L H2O2）會形成較大的聚集體，從而導(dǎo)致MP的起泡能力有所下降。

圖5 氧化后MP起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的變化Fig. 5 Changes in foaming activity (A) and foam stability (B) of MP after oxidation

2.4.2 EAI及ESI的變化

圖6 氧化后MP乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的變化Fig. 6 Changes in emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of MP after oxidation

如圖6A所示，與對照組相比，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L H2O2氧化后MP的EAI降低程度較??；隨著H2O2濃度的增加，MP乳化性降低程度明顯增大（P＜0.05）。此外，氧化3、5 h與氧化1 h相比，MP的ESI顯著降低（圖6B，P＜0.05）。這些結(jié)果與Li Qin等[28]報道的研究結(jié)果相似。過度的氧化環(huán)境會引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化并形成交聯(lián)[5]，肌肉發(fā)生氧化損傷[25]，影響其水分狀態(tài)和乳化特性。

3 結(jié) 論

氧化使白斑狗魚MP羰基含量增加，促進MP交聯(lián)，形成蛋白聚集體并引起MP構(gòu)象的變化；適度的氧化處理顯著提高了白斑狗魚MP的起泡性（P＜0.05），對泡沫穩(wěn)定性影響極低；然而氧化降低了MP蛋白乳化性能，特別是H2O2濃度超過10 mmol/L時，MP的乳化性能明顯降低。本研究結(jié)果表明適度氧化可改善白斑狗魚肌肉蛋白的功能特性。