漆葉化學(xué)成分的分離鑒定

穆怡含， 畢敬豆， 屈曉宇， 鄧小寬， 高 平

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065)

漆樹(shù)(Toxicodendronvernicifluum)是漆樹(shù)科(Anacardiaceae)漆屬(Toxicodendron)植物，該植物為落葉喬木[1].漆樹(shù)在我國(guó)已有大約3000年的栽培歷史[2]，20世紀(jì)80年代篩選出農(nóng)家品種97個(gè)、優(yōu)良品種46個(gè)[3]，種質(zhì)資源豐富.漆樹(shù)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化意義，其樹(shù)皮可分泌生漆，作為天然的樹(shù)脂涂料，果皮可制漆蠟，果核可制取漆油，樹(shù)干可作優(yōu)質(zhì)木料，樹(shù)葉可作飼料[4,5]；髹漆藝術(shù)為人類積淀了豐富的文化財(cái)富[2].另外漆樹(shù)還具有較高的藥用價(jià)值.據(jù)醫(yī)藥典籍記載，其根、木心、皮、花、葉、籽等部位均可入藥，具有止血化瘀、鎮(zhèn)痛、殺蟲(chóng)、治療吐瀉腹痛等功效[6].研究表明，漆樹(shù)的木質(zhì)部富含黃酮，生漆中的主要化學(xué)成分為：漆酶、漆酚、漆多糖等[7,8].

漆葉作為漆樹(shù)的重要副產(chǎn)物，尚未得到充分開(kāi)發(fā)利用，相關(guān)研究也未見(jiàn)報(bào)道.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)漆葉具有較好的抑菌活性，尤其是漆葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位抑菌效果最佳.為深入研究漆葉的抑菌成分，本實(shí)驗(yàn)選取漆葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，以期提高漆葉的利用價(jià)值，也為其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù).

2.1 材 料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 漆葉由四川藍(lán)伯特生物技術(shù)有限責(zé)任公司鑒定并提供.

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 所有試劑均為分析純或色譜純、柱色譜用硅膠200～300目，購(gòu)于成都科龍化工試劑廠.

2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小型粉碎機(jī)(鉑歐五金廠)，R201D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義英峪高科儀器廠)，SHZ循環(huán)水式真空泵(鞏義予華有限責(zé)任公司)，創(chuàng)新通恒LC3000高效液相色譜儀(UV3000紫外檢測(cè)器，P3000高壓輸液泵)，C18柱(YMC-C18-10 μm)，超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振波譜儀(Bruker AV Ⅱ-400/600 MHz，德國(guó)Bruker公司).

圖1 漆葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取相的分離流程圖

2.2 方 法

2.2.1 提取 取干燥的漆葉2.6 kg，用粉碎機(jī)粉碎.將粉碎后的漆葉用乙醇進(jìn)行滲漉，滲漉得到的藥液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，直至沒(méi)有醇味后加入少量水混懸，用乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，得到乙酸乙酯萃取物.

2.2.2 分離純化 乙酸乙酯萃取物經(jīng)甲醇溶解后加入硅膠攪拌均勻，進(jìn)行干法上樣.用甲醇-乙酸乙酯梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層和HPLC檢測(cè)后合并相似成分，得到4個(gè)活性段(Fr.1～Fr.4).Fr.1經(jīng)C18中壓色譜柱，用20%～30%甲醇梯度洗脫，得到Fr.1-1和Fr.1-2組分；Fr.1-1和Fr.1-2經(jīng)高壓制備色譜，以10%～20%乙腈酸梯度洗脫，得到化合物1和化合物7.Fr.2經(jīng)C18中壓色譜柱，用20%～30%甲醇梯度洗脫，得到化合物6.Fr.3經(jīng)C18中壓色譜柱，用20%～30%甲醇梯度洗脫，得到Fr.3-1、Fr.3-2和Fr.3-3組分，將Fr.3-1和Fr.3-2經(jīng)高壓制備色譜，分別用20%、30%的甲醇洗脫，得到化合物2和5；Fr.3-3結(jié)晶得到化合物4.Fr.4經(jīng)C18中壓色譜柱，用20%～30%甲醇梯度洗脫，得到Fr.4-1和Fr.4-2組分；經(jīng)高壓制備色譜，以10%～20%乙腈酸梯度洗脫，得到化合物3和8.

化合物1：白色粉末，1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.02(2H，s，H-2，H-6)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ:120.59(C-1)，108.91(C-2，6)，145.81(C-3，5)，138.37(C-4)，169.92(C-7).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]中的化合物沒(méi)食子酸進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為沒(méi)食子酸.

化合物2：白色粉末.1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:7.16(2H，s，H-2′，6′)，7.07(2H，s，H-2″，6″)，5.93(1H，d，J=8.2 Hz，H-1)，5.25(1H，dd，J=9.1，9.0 Hz，H-2)，5.71(1H，dd，J=8.2，7.9 Hz，H-3)，3.91(1H，m，H-4)，3.95(1H，m，H-5)，4.45(1H，m，H-6a)，4.59(1H，m，H-6b)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:93.44(C-1)，71.13(C-2)，76.10(C-3)，64.21(C-4)，75.38(C-5)，63.82(C-6)，140.55(C-4′)，139.1(C-4″，4″′)，118.26(C-1′)，119.72(C-1″)，119.91(C-1″′)，109.75(C-2′，6′)，109.52(C-2″，6″)，109.48(C-2″′，6″′)，145.89(C-3′，5′)，146.47(C-3″，3″′，5″，5″′)，164.84(C-7′)，166.02(C-7″)，166.89(C-7″′).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中的化合物1,3,6-O-三沒(méi)食子酰葡萄糖進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為1,3,6-O-三沒(méi)食子酰葡萄糖.

化合物3：1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.12，7.11，7.07，7.05(each2H，s，galloyl-H)，6.07(1H，d，J=8.4 Hz，H-1)，5.35(1H，dd，J=8.4，9.6，H-2)，5.32(1H，t，J=9.5 Hz，H-3)，4.56(1H，dd，J=9.6，9.9 Hz，H-4)，4.21(1H，m，H-5)，4.27(1H，d，J=11.2 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：92.49(C-1)，73.21(C-2)，73.17(C-3)，72.42(C-4)，70.75(C-5)，62.30(C-6)，120.57，120.41，120.34，119.67(C-1′×4)，109.67，109.67，109.31，109.16(C-2′×4&C-6′×4)，145.15，145.18，145.07，145.09(C-3′×4&C-5′×4)，165.61，164.98，164.77，164.23(C-7′×4).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]中的化合物1,2,4,6-O-四沒(méi)食子酰葡萄糖進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為1,2,4,6-O-四沒(méi)食子酰葡萄糖.

化合物4：淡黃色粉末，與鹽酸-鎂粉反應(yīng)，顏色變?yōu)榧t色；與碘化鉍鉀反應(yīng)，無(wú)顏色變化.ESI-MSm/z:692.38[M+Na]+，689.47[M-H]-.1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:8.02(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′，6′)，6.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，12.68(1H，s，5-OH)，6.18(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.43(1H，d，J=7.5 Hz，Glc-H-1)，3.06～3.53(6H，m，Glc-H)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:177.89(C-4)，161.69(C-5)，164.22(C-7)，160.34(C-4′)，156.81(C-8a)，156.37(C-2)，133.21(C-3)，130.64(C-2′，6′)，121.06(C-1′)，115.28(C-3′，5′)，104.47(C-4a)，101.43(C-1″)，98.12(C-6)，94.08(C-8)，77.90(C-3″)，76.43(C-5″)，73.86(C-2″)，69.34(C-4″)，60.28(C-6″).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]中的化合物紫云英苷進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為紫云英苷.

化合物5：白色無(wú)定型粉末，與三氯化鐵反應(yīng)為陽(yáng)性，ESI-MSm/z:963.88[M+Na]+，939.78[M-H]-.1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ6.96(2H，s，H-2″″′)，6.90(2H，s，H-2″″)，6.83(2H，s，H-2″′)，6.80(2H，s，H-2″)，6.75(2H，s，H-2′)，6.35(1H，d，J=9.7 Hz，H-1)，5.42(1H，dd，J=2.0，9.7 Hz，H-2)，5.93(1H，t，J=9.6 Hz，H-3)，5.44(d，J=9.7 Hz，H-4)，4.56(m，H-5)，4.57(1H，d，J=9.7 Hz，H-6a)，4.29(d，J=5.0 Hz，H-6b).13C-NMR(151 MHz，DMSO-d6)δ92.82(C-1)，71.43(C-2)，72.98(C-3)，69.12(C-4)，73.58(C-5)，62.44(C-6)，118.41(C-1′)，109.22(C-2′、6′)，146.16(C-3′、5′)，139.54(C-4′)，164.83(C-7′)，118.81(C-1″)，109.36(C-2″、6″)，146.03(C-3″，5″)，139.11(C-4″)，165.64(C-7″)，119.02(C-1″′)，109.51(C-2″′、6″′)，145.97(C-3″′、5″′)，138.83(C-4″′)，166.01(C-7″′)，118.93(C-1″″)，109.14(C-2″″、6″″)，145.93(C-3″″、5″″)，138.97(C-4″″)，165.71(C-7″″)，119.83(C-1″″′)，109.38(C-2″″′、6″″′)，145.85(C-3″″′、5″″′)，138.75(C-4″″′)，166.65(C-7″″′).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]中的已知化合物1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄.

化合物6：無(wú)色針晶.1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.37(1H，d，J=5.3 Hz，H-6)，1.04(3H，s，H-19)，0.97(3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.86(3H，d，J=7.8 Hz，H-29)，0.84(3H，d，J=7.0 Hz，H-26)，0.85(3H，d，J=6.4 Hz，H-27)，0.66(3H，s，H-18)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:36.79(C-1)，29.16(C-2)，71.84(C-3)，39.77(C-4)，140.71(C-5)，121.73(C-6)，31.84(C-7)，31.76(C-8)，50.10(C-9)，36.27(C-10)，20.13(C-11)，37.45(C-12)，42.31(C-13)，56.88(C-14)，24.07(C-15)，28.92(C-16)，56.03(C-17)，11.84(C-18)，19.12(C-19)，37.76(C-20)，18.82(C-21)，34.07(C-22)，26.25(C-23)，45.88(C-24)，29.13(C-25)，19.92(C-26)，19.87(C-27)，23.14(C-28)，12.83(C-29).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]中的已知化合物β-谷甾醇進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為β-谷甾醇.

化合物7：白色針晶.1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.78(1H，s，H-2)，4.35(1H，s，H-3)，3.98(1H，dd，J=12.0，5.2 Hz，H-4)，3.67(1H，dd，J=7.2，4.2 Hz，H-5)，2.69(1H，dd，J=17.9，4.8 Hz，H-6a)，2.11(1H，dd，J=17.9，5.3 Hz，H-6b)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ:129.27(C-1)，137.75(C-2)，72.13(C-3)，68.24(C-4)，67.18(C-5)，31.57(C-6)，167.98(C-7).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]中的已知化合物莽草酸進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為莽草酸.

化合物8：白色粉末.1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ:1.04(1H，d，J=6.0 Hz，H-6″)，3.12～3.94(4H，m，H-2″～5″)，4.45(1H，brs，H-1″)，4.72(1H，d，J=10.4 Hz，H-3)，5.18(1H，d，J=10.4 Hz，H-2)，5.87(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.91(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.78(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，7.31(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，9.67(1H，s，4′-OH)，10.87(1H，s，7-OH)，11.82(1H，s，5-OH)；13C-NMR(100 MHz，DMSO)δ:81.16(C-2)，75.63(C-3)，195.69(C-4)，163.60(C-5)，96.92(C-6)，167.36(C-7)，95.24(C-8)，162.31(C-9)，100.63(C-10)，126.58(C-1′)，128.62(C-2′，6′)，115.49(C-3′，5′)，157.87(C-4′)，101.14(C-1″)，70.29(C-2″)，70.51(C-3″)，71.56(C-4″)，68.80(C-5″)，17.47(C-6″).將該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]中的已知化合物黃杞苷進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本一致，因此可以確定該化合物為黃杞苷.

4 結(jié) 論

此次分離得到的化合物主要分為三大類，即黃酮類、酚酸類和甾醇類物質(zhì).其中化合物2、3、4、7、8是首次從該種植物中分離得到，化合物1、5、6是首次從該種植物的葉中分離得到.此結(jié)果拓寬了對(duì)于漆葉物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為漆葉抑菌產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定及合理有效的開(kāi)發(fā)利用該資源提供了科學(xué)依據(jù).