柴銀口服液超高效液相色譜指紋圖譜及6組分含量測定研究*

關(guān)永霞，莊會芳，袁曉梅，金 鳳，莊建林，孫曉蘭，白 雪，范建偉△

（1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司·中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006）

柴銀口服液源自《傷寒六書》中的柴葛解肌湯方和《溫病條辨》中的銀翹散方，由柴胡、金銀花、黃芩、葛根、連翹等11味中藥材組方，臨床用于治療上呼吸道感染（外感風(fēng)熱證），癥見發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛、咽痛、汗出、鼻塞流涕、咳嗽、舌邊尖紅、苔薄黃［1］。該制劑現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典（一部）》，其標(biāo)準(zhǔn)分別對苦杏仁、薄荷、柴胡、連翹、青蒿、葛根進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷含量［1］，但未能全面反映和評價制劑的整體質(zhì)量?；谥兴幓瘜W(xué)物質(zhì)群組成及其含量特征所建立的中藥化學(xué)指紋圖譜，能較全面地反映中藥的整體質(zhì)量，成為中藥真實(shí)性鑒別、質(zhì)量一致性評價和穩(wěn)定性研究的可靠模式［2］。采用HPLC法建立柴銀口服液的快速特征指紋圖譜，但其分析時間過短，色譜峰及共有峰數(shù)量較少，圖譜信息欠豐富［3］。本研究中基于中藥化學(xué)指紋圖譜定性分析與主要藥效成分定量測定結(jié)合的模式，采用超高效液相色譜（UPLC）法建立柴銀口服液的指紋圖譜，同時測定葛根中葛根素、大豆苷［4］，黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷［5］，連翹中連翹苷、連翹酯苷A［6］6個成分的含量，旨在為全面控制和評價制劑質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity Arc型超高效液相色譜系統(tǒng)，包括PDA檢測器、四元梯度泵、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；XSR105DU/A型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；KS-5200DE型液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；Milli-Q EQ7000型超純水儀（法國Merck公司）。

1.2 試藥

柴銀口服液（魯南厚普制藥有限公司，批號分別為05200081，05200091，05200101，05200171，05200191，05200211，05200231，05200251，05200261，05200271，05200281，05200441，05200451，05200461，05200471，05200481，05200491，05200501，05200511，05200521，05200531，05200541，05200551，05200561，依次編號為S1～S24）；葛根素對照品（批號為110752-201816，含量95.4%），大豆苷對照品（批號為111738-201904，含量93.4%），連翹酯苷A對照品（批號為111810-201707，含量97.2%），黃芩苷對照品（批號為110715-201821，含量95.4%），連翹苷對照品（批號為110821-201816，含量95.1%），漢黃芩苷對照品（批號為112002-201702，含量98.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs?C18柱（50 mm×4.6 mm，2.7μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min時6%A→16%A，0.4 mL/min；30～40 min時16%A→28%A，0.4 mL/min；40～48 min，28%A→60%A，0.4→0.6 mL/min；48～55 min時60%A，0.6 mL/min；55～56 min時60%A→6%A，0.6→0.4 mL/min）；檢測波長：230 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2μL。

2.2 溶液制備

取對照品各適量，精密稱定，置同一50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，制成每1 mL分別含葛根素、大豆苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷0.505 5，0.112 0，0.528 0，1.490 1，0.124 1，0.392 3 mg的混合對照品貯備液；精密量取5 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得每1 mL分別含葛根素、大豆苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷252.73，56.02，264.01，745.04，62.05，196.13μg的混合對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按柴銀口服液處方和工藝分別制備缺葛根、黃芩、連翹藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 參照峰選擇

取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果葛根素峰（11號峰）的分離度好，保留時間適中，故選擇以此為參照峰，標(biāo)記為11（S）。

圖1 超高效液相色譜圖11.Puerarin 15.Daidzin 21.Forsythoside A 24.Baicalin 25.Forsythin 29.Wogonoside A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution without Puerariae Lobatae Radix D.Negative reference solution without Scutellariae Radix E.Negative reference solution without Forsythlae FructusFig.1 UPLC chromatograms

2.3.2 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號為S1）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以葛根素峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，20，24 h時按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以葛根素峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的R S D均小于2.0%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號為S1）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以葛根素峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的R S D均小于2.0%（n=8），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 指紋圖譜的建立及共有峰指認(rèn)

取24批樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖2。將24批樣品的色譜數(shù)據(jù)以CDF文件格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S1號樣品圖譜為參照，以葛根素峰為參照峰，經(jīng)多點(diǎn)校正后自動匹配色譜峰，以平均值法生成指紋圖譜共有模式，詳見圖3。結(jié)果24批樣品中有30個色譜峰被確認(rèn)為共有峰，相應(yīng)共有峰峰面積超過總峰面積的90%。30個共有峰中，通過與對照品圖譜比對，結(jié)合各峰紫外吸收特征，指認(rèn)出11號峰為葛根素峰、15號峰為大豆苷峰、21號峰為連翹酯苷A峰、24號峰為黃芩苷峰、25號峰為連翹苷峰、29號峰為漢黃芩苷峰，且11號及15號峰來自葛根，21號及25號峰來自連翹，24號及29號峰來自黃芩。

圖2 24批柴銀口服液超高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 Superimposed UPLC fingerprint of 24 batches of Chaiyin Oral Liquid

圖3 柴銀口服液超高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.3 Reference UPLC fingerprint of Chaiyin Oral Liquid

2.3.4 相似度分析

將24批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以共有模式為對照圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果24批樣品的相似度依次為0.998，0.975，0.998，0.998，0.981，0.999，0.987，0.989，0.991，0.998，0.999，0.999，0.993，0.995，0.998，0.996，0.979，0.991，0.999，0.972，0.999，0.998，0.995，0.989，平均0.992，R S D為0.80%，表明柴銀口服液各批次制備工藝一致性較好，質(zhì)量較穩(wěn)定。

2.4 含量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果6個目標(biāo)成分在混合對照品溶液和供試品溶液色譜中均有相同保留時間的色譜峰，相鄰色譜峰分離度均大于1.5，對稱因子均在0.90～1.10之間，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇制成系列混合對照品溶液。精密吸取2μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表2，可見儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，20，24 h時按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表2，可見供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（編號為S1）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2，可見方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號為S1）1 mL，共6份，置10 mL容量瓶中，分別精密加入2.2項(xiàng)下混合對照品溶液各5 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of precision，stability，repeatability and recovery test

2.4.2 樣品含量測定

取24批（S1~S24）樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 24批樣品中6個成分含量測定結(jié)果（μg/mL，n=3）Tab.3 Results of content determination of six components in 24 batches of samples（μg/mL，n=3）

3 討論

柴銀口服液方中金銀花、連翹清熱解毒，共為君藥；柴胡解表退熱，葛根解肌透邪，薄荷清利頭目，青蒿清透熱邪，助君藥加強(qiáng)疏散風(fēng)熱之力，共為臣藥；黃芩善清上焦熱，魚腥草清熱解毒，二者助君藥以清熱，桔梗、杏仁宣降肺氣以止咳，共為佐藥；桔梗引藥上行，兼為使藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、利咽止咳之功效［7］。該制劑成分較復(fù)雜，單一波長下難以檢測全部成分。本試驗(yàn)中采用PDA檢測器于190～400 nm波長范圍內(nèi)對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，并參考文獻(xiàn)［8-16］，比較了230，254，280，327 nm波長處色譜峰的數(shù)量、峰形、分離度及基線是否平穩(wěn)等因素。結(jié)果顯示，230 nm波長處色譜峰數(shù)較多，峰間分離度良好，基線相對平穩(wěn)，故確定檢測波長為230 nm。本試驗(yàn)中以色譜峰峰形、峰間分離度為評價指標(biāo)，對流動相系統(tǒng)（甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液），柱溫（30，35，40℃），流速（0.4，0.5，0.6 mL/min）等條件進(jìn)行考察，結(jié)果在以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相、柱溫35℃、流速0.4～0.6 mL/min條件下，經(jīng)梯度洗脫，所得供試品溶液的色譜圖基線平穩(wěn)，各主要色譜峰分離效果最佳。

針對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的不足，本試驗(yàn)中采用了UPLC法建立了柴銀口服液指紋圖譜共有模式，確認(rèn)了30個共有峰。結(jié)合對照品圖譜信息，對葛根素（11號峰）、大豆苷（15號峰）、連翹酯苷A（21號峰）、黃芩苷（24號峰）、連翹苷（25號峰）和漢黃芩苷（29號峰）6個成分進(jìn)行了指認(rèn)，并實(shí)現(xiàn)了對上述6個成分含量的同時測定。

綜上所述，所建立的UPLC指紋圖譜結(jié)合含量測定的UPLC法，能更全面地表征柴銀口服液的產(chǎn)品質(zhì)量。