某院耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性分析*

陳寅，欒和偉(江蘇省人民醫(yī)院句容分院檢驗(yàn)科，江蘇句容 212400)

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，容易引起醫(yī)院內(nèi)和醫(yī)院間的感染暴發(fā)流行和跨地區(qū)的水平傳播。鮑曼不動(dòng)桿菌感染通常發(fā)生于身患嚴(yán)重疾病、正在接受侵襲性操作和免疫抑制劑治療以及抵抗力低下的患者，可引起呼吸道感染、傷口及術(shù)后感染、繼發(fā)性腦膜炎、敗血癥和尿路感染等。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物特別是碳青霉烯類抗菌藥物，曾被認(rèn)為是有效的治療藥物，廣泛用于控制鮑曼不動(dòng)桿菌感染[1]。然而，近年來鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其耐藥率不斷上升，耐藥菌株在院內(nèi)甚至地區(qū)間存在播散，為醫(yī)院感染防控帶來挑戰(zhàn)。本研究通過對(duì)碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因和耐藥性進(jìn)行分析，以期為碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的有效治療提供參考。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集江蘇省人民醫(yī)院句容分院2019年1月—2020年12月臨床分離的對(duì)亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌47例，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606，均來源于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。患者年齡為26～96歲；其中，男性35例(74.5%)，女性12例(25.5%)；大于60歲患者33例(70%)。47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌來源于痰標(biāo)本43株(91%)，來源于胸水、血液、尿液以及傷口分泌物各1株；來源于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)23例(48.94%)，呼吸內(nèi)科10例(21.28%)，神經(jīng)外科6例(12.77%)，神經(jīng)內(nèi)科5例(10.64%)，骨科2例(4.26%)，腫瘤科1例(2.13%)。

1.2主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套革蘭陰性菌鑒定GN卡和藥敏GN335卡(法國生物梅里埃公司)，血平板、麥康凱平板及巧克力平板(鄭州安圖生物公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，電泳分析成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，PCR試劑、引物合成(上海邁浦生物科技有限公司)。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn) 菌株的分離、培養(yǎng)參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)[2]進(jìn)行。微生物的鑒定和藥敏分析用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套革蘭陰性菌鑒定GN卡和藥敏GN335卡。結(jié)果判定參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100 2020年標(biāo)準(zhǔn)。

1.4耐藥基因檢測 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[3]，合成鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51和blaOXA-58引物，引物信息見表1。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用多重PCR法檢測菌株攜帶耐藥基因。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq Master Mix (Dye Plus)預(yù)混液10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，細(xì)菌模板2 μL，加雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 碳青霉烯酶基因的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用WHONET5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Excel表進(jìn)行最終敏感、中介和耐藥的計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南等16這種臨床常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。所有菌株對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南和美羅培南)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗菌藥物(替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(氨曲南)以及三代頭孢菌素類(頭孢他啶)具有耐藥性。所有菌株對(duì)多肽類抗菌藥物黏菌素敏感；只有2株對(duì)四環(huán)素類替加環(huán)素有抗性(耐藥性4.2%)；磺胺類復(fù)方磺胺甲噁唑?qū)话氲木幸种菩Ч?敏感性46.8%)。

2.2基因檢測結(jié)果 47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，blaKPC-2、blaIMP、blaVIM以及blaGES基因檢測結(jié)果為陰性，2株檢出blaOXA-24(4.3%)，32株檢出blaOXA-58基因(68.1%)，38株檢出blaNDM-1基因(80.9%)，42株檢出blaOXA-23(89.4%)，47株檢出blaOXA-51基因(100%)。部分電泳結(jié)果見圖1、圖2。

表2 碳青酶烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性(%)

注：M，DL 2 000 DNA marker;1～2,空白對(duì)照;2～6，blaNDM-1基因陽性擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為982 bp。

注：M，DL 2 000 DNA marker;1，空白對(duì)照;2～5，blaOXA-51基因陽性擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為353 bp；6，ATCC 19606標(biāo)準(zhǔn)菌株。

3 討論

對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌在世界范圍內(nèi)的廣泛流行，被世界衛(wèi)生組織列為對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)構(gòu)成最大威脅的耐藥菌之一[4]。根據(jù)2018年CHINET數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為77.1%和78.1%，是2006年耐藥率的近2倍[5]。本研究中耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌除黏菌素(耐藥率0)、替加環(huán)素(耐藥率4.2%)和米諾環(huán)素(耐藥率48.9%)外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率>50%，建議使用聯(lián)合用藥，亞胺培南+多黏菌素E和米諾環(huán)素+多黏菌素E兩種組合對(duì)CRAB具有更好的抑菌效果[6]。本研究中的菌株70%為60歲以上患者，91%來源于痰標(biāo)本，這可能與其傳播途徑和鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制有關(guān)，因?yàn)轷U曼不動(dòng)桿菌自身黏附能力極強(qiáng)，可以黏附在人體的不同組織和器官中引起感染，尤其是對(duì)人體的肺支氣管上皮細(xì)胞的親和力最高，因此極易通過外界氣體傳播或在支氣管插管、氣管切開等操作過程中進(jìn)入呼吸道[7]，引起上呼吸道的感染[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，老年多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎患者采用替加環(huán)素輔助治療，可有效改善患者的臨床癥狀，降低患者的炎癥因子水平，同時(shí)具有較高的藥物安全性[9]。

臨床分離耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，與產(chǎn)生碳青霉烯酶、外排泵基因、整合子基因的大量表達(dá)均有關(guān)[3]。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制中以產(chǎn)碳青霉烯酶為主。在耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌分離菌株中，與碳青霉烯水解酶相關(guān)的有A、B和D類碳青霉烯酶，A類中blaGES型分布中東地區(qū)，而blaKPC型罕見；B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，具有更強(qiáng)的水解活性[10]，其中blaIMP、blaVIM、blaNDM型在鮑曼不動(dòng)桿菌中均有檢出；D類blaOXA型酶在對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性中具有更重要的作用[11]。本研究中38株檢出blaNDM-1基因(80.9%)，42株檢出blaOXA-23基因(89.4%)，碳青霉烯酶流行情況同上述研究結(jié)果相同。blaOXA-51基因是鮑曼不動(dòng)桿菌染色體攜帶的天然耐藥基因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為blaOXA-51基因可以作為快速確定鮑曼不動(dòng)桿菌的一個(gè)分子標(biāo)記[12]，本研究結(jié)果也支持上述觀點(diǎn)，所有菌株均檢出blaOXA-51基因。此次分析的47株耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA-23檢出率為89.4%，高于四川地區(qū)某院48 株碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA-23檢出率70.8%[13]，說明不同區(qū)域、不同等級(jí)醫(yī)院耐藥基因的檢出率存在一定的差異，這可能于各個(gè)醫(yī)院的用藥習(xí)慣、抗菌藥物的限制和菌株流行情況有關(guān)。另外，本研究中38株檢出blaNDM-1基因，而攜帶blaNDM-1的細(xì)菌具有強(qiáng)大的致病力和耐藥性，對(duì)碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等抗菌藥物耐藥，需合理選擇抗菌藥物治療。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，blaNDM-1基因位于可移動(dòng)元件質(zhì)粒上，攜帶blaNDM-1的鮑曼不動(dòng)桿菌可通過質(zhì)粒接合，使其獲得部分耐藥性，該基因具有跨種屬轉(zhuǎn)移的能力，需加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)blaNDM-1細(xì)菌的檢測，預(yù)防其暴發(fā)流行[14]。