基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接研究活絡效靈丹治療冠心病的分子機制

趙佳鑫，張娟利，馬陽，黃少杰，陳海霞，牟菲，文愛東，*，丁一*（.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 7046；.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 7003）

冠狀動脈粥樣硬性化心臟病簡稱為“冠心病”（coronary heart disease，CHD），是由于冠狀動脈硬化導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。據(jù)《中國心血管健康與疾病2020》報告，自2018年以來，我國冠心病患者的死亡率快速增加，冠心病已經(jīng)成為危害國人生命健康的重要疾病之一。

活絡效靈丹出自于我國著名醫(yī)家張錫純的《醫(yī)學衷中參西錄》，是用于治療氣血凝滯、心腹疼痛的著名方劑。該方由四味中藥組成，分別是丹參（

Salvia miltiorrhiza

Bge）、當歸（

Angelica sinensis Oliv.

Diels）、乳香（

Boswellia carterii

Birdw）和沒藥（

Commiphora myrrha

Engl）。方中當歸和丹參能活血祛瘀、涼血消癰又兼以養(yǎng)血；而乳香、沒藥可以活血行氣、通經(jīng)活絡。四藥配伍共同發(fā)揮活血通絡，止痛祛瘀的功效。白幸華等利用丹參飲聯(lián)合活絡效靈丹加味治療急性心肌梗死并發(fā)急性左心衰不僅取得了良好的治療效果，而且無不良反應發(fā)生；楊德林在活絡效靈丹的基礎方劑上加味治療冠心病解除了冠狀動脈痙攣?；罱j效靈丹雖在臨床中應用頻繁，但其在治療冠心病方面缺乏深入的研究，尤其是有效成分和作用機制尚不明確，需要進一步的研究。

隨著生物信息學的發(fā)展，網(wǎng)絡藥理學已經(jīng)成為研究中藥的一種非常有效的科研方法，它可以系統(tǒng)、全面地揭示中藥生物活性成分與其潛在作用機制之間的關系，因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法，探究活絡效靈丹治療冠心病的分子作用機制，為進一步的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器

活絡效靈丹（北京同仁堂，由丹參、當歸、生明乳香、生明沒藥組成），GAPDH 抗體（批號：2118s，CST）；4%多聚甲醛組織固定液（批號：G1101）、PTGS2 抗體（批號：GB11077-1，GB11077-2）、HRP 標記的山羊抗兔IgG（批號：GB23303）（武漢塞維爾）。RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；NIKON ECLIPSE C1 正置熒光顯微鏡（日本尼康）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：A020-2，南京建成）。

1.2 實驗動物

雄性SD 大鼠40 只，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心[SCKX（軍）字第2007-007 號]，體質量200 ～250 g，適應性飼養(yǎng)一周，期間自由飲水，12 h 循環(huán)光照，標準飼料喂養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件

本研究使用的數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件信息
Tab 1 Database，data analysis platform and software information

名稱網(wǎng)址TCMSP 2.3https：//tcmspw.com/tcmsp.php GeneCardshttps：//www.genecards.org/DrugBankhttps：//go.drugbank.com/Uniprothttps：//www.uniprot.org/OMIMhttps：//omim.org/DisGeNEThttps：//www.disgenet.org/search DAVID 6.8https：//david.ncifcrf.gov/ImageGPhttp：//www.ehbio.com/ImageGP PDBhttps：//www.rcsb.org/STRINGhttps：//string-db.org/Cytoscape 3.7.1https：//cytoscape.org/

2 方法與結果

2.1 網(wǎng)絡藥理學研究

2.1.1 活絡效靈丹活性成分篩選及相關靶點收集 在TCMSP2.3 數(shù)據(jù)庫中分別以“丹參”“當歸”“乳香”和“沒藥”為關鍵詞檢索四味中藥的化學成分，以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，上皮滲透性（Caco-2）≥－0.4 和藥物半衰期（HL）≥4 為篩選條件并去重后獲得活絡效靈丹83 個有效成分，其中丹參48 個，當歸2 個，乳香4 個和沒藥31 個。然后，通過TCMSP2.3收集靶點發(fā)現(xiàn)共有67 個有效成分有靶點（見表2），16 個有效成分未收到相關靶點，將所有靶點合并去重后使用Uniport 數(shù)據(jù)庫轉化為基因名稱，共收集到216 個靶點。

表2 活絡效靈丹中有靶點的67 個有效成分表
Tab 2 Information of 67 compounds with targets in Huoluo Xiaoling pill

No.化合物 ID成分名稱OB 上皮滲透性 DLHL 來源藥材1MOL001601 1，2，5，6-tetrahydrotanshinone38.750.960.36 18.05丹參2MOL001659 poriferasterol43.831.440.765.34丹參3MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol36.911.450.755.07丹參4MOL002222 sugiol36.111.140.28 14.62丹參5MOL002651 dehydrotanshinone Ⅱ A43.761.020.423.71丹參6MOL000006 luteolin36.160.190.25 15.94丹參7MOL007036 5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one 33.771.190.29 14.91丹參8MOL007041 2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione40.861.230.23 14.89丹參9MOL007045 3α-hydroxytanshinoneⅡa44.930.530.44 23.78丹參10 MOL007048（E）-3-[2-（3，4-dihydroxyphenyl）-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid 48.240.180.318.87丹參11MOL007049 4-methylenemiltirone34.351.250.23 14.6丹參12 MOL007050 2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde 62.780.350.47.89丹參13 MOL007058 formyltanshinone73.440.540.42 24.12丹參14 MOL007059 3-beta-hydroxymethyllenetanshiquinone32.160.380.41 22.51丹參15 MOL007061 methylenetanshinquinone37.071.030.36 24.33丹參16 MOL007068 przewaquinone B62.240.390.41 24.94丹參17 MOL007069 przewaquinone c55.740.420.423.7丹參18 MOL007070（6S，7R）-6，7-dihydroxy-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 41.31－0.060.45 22.54丹參19 MOL007071 przewaquinone f40.31－0.090.46 22.45丹參20 MOL007077 sclareol43.670.840.214.71丹參21 MOL007079 tanshinaldehyde52.470.570.45 23.49丹參22 MOL007081 danshenol B57.950.530.564.28丹參23 MOL007082 danshenol A56.970.330.525.15丹參24 MOL007085 salvilenone30.381.460.38 20.81丹參25 MOL007088 cryptotanshinone52.340.950.417.3丹參26 MOL007093 dan-shexinkum d38.880.670.55 30丹參27 MOL007094 danshenspiroketallactone50.430.880.31 15.19丹參28 MOL007098 deoxyneocryptotanshinone49.40.850.29 27.17丹參29 MOL007100 dihydrotanshinlactone38.681.260.325.42丹參30 MOL007101 dihydrotanshinoneⅠ45.040.950.36 18.32丹參31 MOL007108 isocryptotanshi-none54.980.930.39 31.92丹參

續(xù)表2

No.化合物 ID成分名稱OB 上皮滲透性 DLHL 來源藥材32MOL007111 isotanshinone Ⅱ49.921.030.424.73丹參33MOL007115 manool45.041.280.25.81丹參34MOL007119 miltionone Ⅰ49.680.350.32 41.49丹參35 MOL007122 miltirone38.761.230.25 14.82丹參36 MOL007124 neocryptotanshinone Ⅱ39.460.760.23 26.98丹參37 MOL007125 neocryptotanshinone52.490.350.32 14.46丹參38 MOL007127 1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione34.720.50.37 37.89丹參39 MOL007130 prolithospermic acid64.370.10.318.82丹參40 MOL007150（6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-quinone 75.390.030.46 23.45丹參41 MOL007151 tanshindiol B42.670.050.45 22.25丹參42 MOL007152 przewaquinone E42.85－0.040.45 22.44丹參43 MOL007154 tanshinone ⅡA49.891.050.423.56丹參44 MOL007155（6S）-6-（hydroxymethyl）-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 65.260.440.45 23.48丹參45 MOL007156 tanshinone Ⅵ45.640.480.315.21丹參46 MOL000358 beta-sitosterol36.911.320.755.36 當歸、沒藥47 MOL000449 stigmasterol43.831.440.765.57 當歸、沒藥48 MOL001006 poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol42.981.450.765.48沒藥49 MOL001013 mansumbinoic acid48.110.326.67沒藥50 MOL001022 11α-hydroxypregna-4，17（20）-trans-diene-3，16-dione36.620.820.474.53沒藥51 MOL001031 epimansumbinol61.811.360.44.71沒藥52 MOL001040（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one42.360.380.21 16.83沒藥53 MOL001049 16-hydroperoxymansumbin-13（17）-en-3β-ol41.050.50.495.7沒藥54 MOL001052 mansumbin-13（17）-en-3，16-dione41.780.780.454.29沒藥55 MOL001061（16S，20R）-dihydroxydammar-24-en-3-one37.340.690.787.59沒藥56 MOL001062 15α-hydroxymansumbinone37.511.410.444.73沒藥57 MOL001063 28-acetoxy-15α-hydroxymansumbinone41.850.310.677.85沒藥58 MOL001095 isofouquierone40.950.950.788.48沒藥59MOL001126 [（5aS，8aR，9R）-8-oxo-9-（3，4，5-trimethoxyphenyl）-5，5a，6，9-tetrahydroisobenzofurano[6，5-f][1，3]benzodioxol-8a-yl] acetate 44.080.60.913.01沒藥60MOL001131 phellamurin_qt56.60.140.39 14.89沒藥61MOL001138（3R，20S）-3，20-dihydroxydammar-24-ene37.491.480.756.94沒藥62MOL001156 3-methoxyfuranoguaia-9-en-8-one35.151.040.187.97沒藥63 MOL000098 quercetin46.430.050.28 14.4沒藥64 MOL000988 4，17（20）-（cis）-pregnadiene-3，16-dione51.420.890.484.3沒藥65 MOL000996 guggulsterol Ⅳ33.590.930.744.83沒藥66 MOL001215 tirucallol42.121.380.756.9乳香67 MOL001241 O-acetyl-α-boswellic acid42.730.680.74.13乳香

2.1.2 冠心病靶點的獲取 以“Coronary Heart Disease”為關鍵詞分別在DisGeNET、DrugBank、GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中搜索冠心病靶點。為了確保冠心病靶點的準確性，將DisGeNET 數(shù)據(jù)庫的篩選條件設置為Score ≥0.3，GeneCards數(shù)據(jù)庫設置relevance score ≥30。合并4 個數(shù)據(jù)庫的檢索結果并去重后得到695 個冠心病靶點。

2.1.3 共有靶點獲取與PPI 網(wǎng)絡構建 將216 個活絡效靈丹的成分靶點與695 個冠心病靶點取交集獲得50 個共有靶點。然后，將共有靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設置為“人類”的同時設置“置信分數(shù)≥0.4”獲得PPI 相互作用網(wǎng)絡。將作用網(wǎng)絡導入Cytoscape3.7.1 軟件，利用cytoHubba插件計算排名前10 的hub 蛋白。結果顯示hub 蛋白分別為：IL6、TNF、VEGFA、TP53、MMP9、PTGS2、ICAM1、CASP3、CCL2 和IL1

β

，見圖1。

圖1 共有靶點的PPI 網(wǎng)絡圖Fig 1 PPI network diagram of common targets

2.1.4 GO 生物富集分析與KEGG 通路富集分析 將共有靶點上傳至DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫獲取GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。選取

P

＜0.05 的分析結果并根據(jù)富集的基因數(shù)目進行可視化處理。獲得了258 個生物學過程、23 個細胞成分以及37 個分子功能。選擇GO 生物富集分析的10 條結果繪制柱狀圖見圖2。結果顯示活絡效靈丹主要影響凋亡過程負調控，正向調節(jié)細胞增殖、炎癥反應和應對缺氧等生物學過程；對細胞成分的影響主要在細胞質、生物質膜、線粒體、內質網(wǎng)膜等部位；通過與不同的酶結合，調控不同細胞因子活性等方面影響分子功能。通過KEGG 通路富集分析，獲得76 條有效通路。主要涉及炎癥反應、凋亡、缺氧反應等信號通路，提示活絡效靈丹可能是通過這些通路發(fā)揮治療冠心病的作用，前20 條通路氣泡圖，見圖3。

圖2 活絡效靈丹GO 富集分析Fig 2 GO enrichment and analysis of Huoluo Xiaoling pill

圖3 KEGG 通路富集分析結果前20 展示Fig 3 Top 20 pathways based on KEGG pathway enrichment analysis

2.1.5 構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖 基于“2.1.3”項下的hub 蛋白逆向獲得對應的有效成分，選取KEGG 富集的前20 條通路繪制“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。如圖4 所示，通過對網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)在靶點排序中Degree 值排序前5 的靶點分別是PTGS2、TNF、IL6、CASP3 和IL1

β

。在有效成分的Degree 值排序中前5 的有效成分分別是槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇。提示這些成分與靶點可能是活絡效靈丹治療冠心病的重要成分與靶點。

圖4 “成分-靶點-通路”圖Fig 4 Component-target-pathway network

2.1.6 分子對接驗證核心靶點與有效成分 根據(jù)“成分-靶點-通路”圖篩選出的核心靶點PTGS2、TNF、IL6、CASP3、IL1

β

與核心成分槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇、豆甾醇進行兩兩對接。首先，從TCMSP2.3 數(shù)據(jù)庫下載核心成分的結構并以mol2 格式保存。然后從RCSB（PDB）數(shù)據(jù)庫下載核心靶點的配體結構，使用Autodock Vina 對接每個成分和配體。結合能＜－5 kcal·mol的對接分數(shù)表明該化合物與靶點之間具有良好的結合活性，結合能越低，說明結合活性越好。對接結果見表3，大部分靶點與有效成分具有較好的結合活性，提示網(wǎng)絡藥理預測的相關靶點具有較高的可靠性。將結合活性最強的前6 個成分靶點對接結果利用Discovery Studio 可視化，如圖5 所示。

圖5 分子對接結果可視化Fig 5 Visualization of molecular docking results

表3 活絡效靈丹核心成分與關鍵靶點對接結果
Tab 3 Docking results of core components and key targets

靶點結合能/（kcal·mol－1）槲皮素木犀草素丹參酮ⅡAβ-谷甾醇豆甾醇曲美他嗪PTGS2-5KIR－8.5－8.4－8.2－2.9－5－6.9 IL6-4CNI－4－4.4－4.2－3.9－4.4－3.3 TNF-2AZ5－7.7－7.8－8.5－7.8－8.3－5.8 CASP3-3DEI－7.5－7.8－7.6－8.8－8.7－5.8 IL1β-5R88－6.7－7.3－7.1－7.1－7.2－5.4

2.2 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料使用均數(shù)±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析，

P

＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3 動物實驗驗證

2.3.1 大鼠心肌缺血模型建立 將SD 大鼠隨機分為4 組，假手術組、模型組（等體積的生理鹽水）、活絡效靈丹高劑量組（5.4 g·kg）和低劑量組（2.7 g·kg），每組10 只，術后第1日開始給藥，第7日末次給藥2 h 后麻醉大鼠，腹主動脈取血并收集心臟組織。

分組完成后麻醉大鼠并連接12 導聯(lián)心電圖監(jiān)測心率，經(jīng)口無創(chuàng)插管連接呼吸機，對左胸進行消毒，打開左胸3、4 肋間隙，撕開心包膜，結扎左心耳下緣以下2 mm 處的左前降支（LAD），最后擠壓胸腔內空氣并逐層縫合。隨后放入恒溫箱中等待蘇醒。假手術組大鼠只開胸，不結扎。

2.3.2 大鼠血漿LDH 測定 腹主動脈取血收集各組大鼠血液1 ～3 mL，3000 r·min離心20 min 后收集血漿，按照試劑盒步驟嚴格操作測定LDH 含量，結果見表4。

表4 大鼠血漿中LDH 含量(±s， ＝3)
Tab 4 Content of plasma LDH in rats of each group (± s， ＝3)

注：與假手術組相比， ＜0.01；與模型組相比， ＜0.05， ＜0.01。
Note：Compared with the sham operation group， ＜0.01；compared with the model group， ＜0.05， ＜0.01.

組別LDH/（U·L－1）假手術組1060±141.4模型組1906±209.5**活絡效靈丹低劑量組1406±185.3#活絡效靈丹高劑量組1072±94.67##

2.3.3 心肌組織組織病理學檢查 取新鮮大鼠心臟組織用預冷的生理鹽水反復沖洗后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h，隨后石蠟包埋，制片，脫蠟至水，使用HE 染色和Masson 染色后，置于顯微鏡下觀察心肌組織的病理學變化并采集圖像，結果見圖6，HE 染色結果顯示假手術組的心肌組織結構排列緊密，細胞形態(tài)均勻，未見明顯的心肌損傷；與假手術組相比，模型組心肌組織結構松散，肌纖維嚴重斷裂，并伴有大量炎性細胞浸潤和細胞間質水腫；活絡效靈丹低劑量組心肌結構松散，中度炎性細胞浸潤和間質水腫；活絡效靈丹高劑量組心肌排列基本完整，少量炎性細胞浸潤，未見明顯的細胞間質水腫及少量纖維斷裂，說明活絡效靈丹可以不同程度的減輕心肌損傷與心肌炎癥。

Masson 染色如圖6 所示，假手術組的心肌組織排列緊密，細胞核形態(tài)表達正常，只有少量的纖維沉積；而模型組可見大量膠原沉積和纖維裂層，表明心肌纖維化程度非常嚴重；與模型組比較，活絡效靈丹不同劑量組均能明顯的減少膠原纖維的增生，改善心肌纖維化。

圖6 各組大鼠心肌組織HE 染色與Masson 染色（×200）Fig 6 HE staining and Masson staining of the myocardial tissues of rats in each group（×200）

2.3.4 免疫熒光染色法 將心臟組織的石蠟切片脫蠟至水，切片放入抗原修復緩沖液中隨后加入血清封閉30 min，切片與一抗于4℃下孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min。隨后與二抗室溫避光孵育50 min；重復上述洗滌步驟后，封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。免疫熒光切片和光密度測定結果如圖7 所示，與假手術組相比，模型組大鼠心臟的PTGS2 蛋白熒光表達強度顯著增強（

P

＜0.01）；與模型組相比，活絡效靈丹低劑量組與高劑量組均能夠顯著降低PTGS2 蛋白的熒光表達強度（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

圖7 各組心肌組織的PTGS2 熒光染色與半定量分析（×400，n ＝3）Fig 7 PTGS2 fluorescence staining and semi-quantitative analysis in each group（×400，n ＝3）

2.3.5 蛋白免疫印跡法 取新鮮的心肌組織200 mg 加入2 mL 預制的蛋白裂解液置于冰上打碎勻漿，靜置30 min 后，4℃、12 000 r·min離心15 min。取部分上清液BCA 蛋白法測定蛋白質濃度。其余上清液制成蛋白樣品后，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（PTGS2）在4℃下孵育過夜，次日PVDF 膜洗滌3 次后加入二抗并在室溫下孵育1 h，清洗PVDF膜3 次，采用ECL 法進行顯色，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDOCTM XRS ＋，BIO-RAD）掃描圖像。結果如圖8 所示，模型組大鼠心肌組織中的PTGS2 蛋白表達量顯著高于假手術組（

P

＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)活絡效靈丹不同劑量組治療后均能夠有效降低PTGS2 的表達量，尤其是活絡效靈丹高劑量組的治療效果較為顯著（

P

＜0.05）。

圖8 各組大鼠心肌組織中的PTGS2 蛋白表達水平（n ＝3）Fig 8 Expression level of PTGS2 protein in the myocardial tissues of rats in each group（n ＝3）

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學對活絡效靈丹防治冠心病的作用靶點和相關通路進行挖掘，探究其可能的分子機制。并通過PPI 網(wǎng)絡分析和“成分-靶點-通路”圖篩選出了活絡效靈丹治療冠心病的5個核心成分與5 個核心靶點。最后通過分子對接和動物實驗對其藥效和相關分子機制進行了初步驗證。

通過“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡分析，提示槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇等可能是活絡效靈丹治療冠心病的主要成分。何亞磊等通過建立缺血再灌注（MIRI）模型發(fā)現(xiàn)槲皮素可以降低大鼠的IL-6、TNF-

α

和IL-1

β

水平，提示槲皮素可以改善相關的炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠有效降低MIRI 大鼠的NF-

κ

B 表達，提示木犀草素可能通過NF-

κ

B 信號通路抑制炎癥反應。丹參酮ⅡA 可以阻止I

κ

B磷酸化和NF-

κ

B 的激活，從而抑制炎癥反應，減輕心肌細胞凋亡和纖維化過程；

β

-谷甾醇可以降低IL-1

β

、IL-6 和TNF-

α

的水平，抑制炎癥反應；同時，

β

-谷甾醇可以通過PPAR

γ

/NF-

κ

B信號通路發(fā)揮對心肌的保護作用。豆甾醇與

β

-谷甾醇均為重要的植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以降低脂多糖（LPS）誘導的COX-2 和iNOS蛋白的表達。PPI 網(wǎng)絡與“成分-靶點-通路”圖表明PTGS2、TNF、IL-6、CASP3 和IL-1

β

具有較高的Degree 值，可能是活絡效靈丹治療冠心病的核心靶點。其中，PTGS2、TNF、IL-6 和IL-1

β

均與炎癥過程密切相關，提示活絡效靈丹可能主要通過抑制炎癥反應發(fā)揮治療冠心病的作用。PTGS2 也稱為環(huán)氧合酶2（COX-2），主要存在于炎癥細胞內，比如組織損傷的內皮細胞、成纖維細胞等，在各種炎癥因子的刺激下，COX-2 會上調損傷部位的PGE2、PGI2 和TXA1 的含量，使炎癥反應和組織損傷進一步加劇。Scheuren 等在實驗中發(fā)現(xiàn)抑制COX-2 的表達后能減少心肌梗死面積，其機制是減少巨噬細胞在梗死區(qū)域和邊緣的浸潤，且能抑制心臟損傷部位的成纖維細胞增殖而減少心肌梗死。此外，抑制COX-2 表達還可以改善內皮依賴性血管舒張功能，減少冠心病的輕度慢性炎癥和氧化應激水平。童靜燕等通過大鼠MIRI 模型發(fā)現(xiàn)活絡效靈丹給藥組能夠明顯下調心肌組織中IL1-

β

、TNF-

α

和IL-6 的表達水平，降低心肌組織中的炎癥水平，這一研究結果與預測的核心靶點相一致。根據(jù)GO 生物富集分析和KEGG 信號通路分析，發(fā)現(xiàn)活絡效靈丹治療冠心病的核心成分與靶點主要參與調控炎癥反應信號通路，如TNF、NF-

κ

B 等關鍵的炎癥信號相關通路，說明抑制炎癥反應可能是治療冠心病的主要通路之一。

基于網(wǎng)絡藥理學分析結果與分子對接結果，發(fā)現(xiàn)PTGS2 在“成分-靶點-通路”圖中Degree值排名第一，與多個核心成分具有較好的結合活性，同時參與多條信號通路的調節(jié)，于是對核心蛋白PTGS2 進行了相關實驗驗證。研究證明活絡效靈丹可以有效抑制心肌組織中PTGS2 的表達。此外，本研究還通過檢驗大鼠血漿LDH 含量，HE 染色與Masson 染色比對病理組織切片，發(fā)現(xiàn)活絡效靈丹不同劑量組能不同程度地改善心肌缺血的病理學狀態(tài)，明確了活絡效靈丹對冠心病的治療作用。

總之，本研究為之后活絡效靈丹治療冠心病的深入研究與臨床研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持和探索方向。但是由于網(wǎng)絡藥理學研究的局限性，后續(xù)還需開展更加深入的研究。