特香型白酒大曲中一株耐熱產(chǎn)淀粉酶地衣芽孢桿菌的分離和鑒定

游 勇，吳曉玉，廖家富，吳生文，廖 昶，王 飛，胡余糧，林鈺寬，孫輝凡，丁忠濤

（1.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；3.四特酒有限責(zé)任公司，江西 樟樹(shù) 331200）

我國(guó)白酒生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方式，用曲釀酒是我國(guó)白酒生產(chǎn)的特色。微生物制曲技術(shù)被譽(yù)為中國(guó)“第五大發(fā)明”。釀酒先輩們從實(shí)踐中總結(jié)出了“曲乃酒之骨”“有好酒必有好曲”“曲定酒型”等精辟論斷。大曲不僅是白酒固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)所必需的接種劑和糖化發(fā)酵劑，同時(shí)大曲生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的大量微生物代謝產(chǎn)物和香味物質(zhì)也直接或間接地形成白酒的風(fēng)味成分，對(duì)白酒的香型和風(fēng)格有決定作用。

在不同香型的白酒大曲中，微生物菌群結(jié)構(gòu)具有明顯的差異性。在高溫白酒大曲中占優(yōu)勢(shì)地位的微生物菌群為耐熱和嗜熱微生物，比如芽孢桿菌和耐熱的霉菌。目前已經(jīng)從多種香型的白酒大曲中篩選分離到芽孢桿菌功能菌株。向慧平等從發(fā)酵階段和儲(chǔ)存階段的濃香型大曲樣品中均分離到了地衣芽孢桿菌。劉桂君等從清香型白酒大曲和酒醅中分離鑒定出12 株地衣芽孢桿菌。黃曉寧等從清香型大曲中優(yōu)選出地衣芽孢桿菌B.L-1 和枯草芽孢桿菌B.S-1，并將其強(qiáng)化接種應(yīng)用于白酒釀造過(guò)程，發(fā)酵結(jié)束的酒醅中四甲基吡嗪等代謝物的含量顯著升高。在醬香型高溫大曲中芽孢桿菌更是大量存在。朱德文等從醬香型高溫大曲中分離到1 株產(chǎn)焦香、醬香可用于高溫型大曲酒增香提質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌MT6。從茅臺(tái)大曲核心層分離到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生眾多茅臺(tái)酒的特征香味化合物。

特香型白酒是中國(guó)白酒的十二大香型之一，形成了“濃頭醬尾清中間，三香俱備猶不靠”的典型風(fēng)格。特香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)與釀造用的大曲密切相關(guān)。特香型大曲屬于中偏高溫曲，其制曲原料獨(dú)特，由面粉、小麥麩和酒糟加水?dāng)嚢鑹褐贫?，在曲房中自然固態(tài)發(fā)酵的頂溫在55 ℃左右。在特香型大曲制曲過(guò)程中摻入新鮮出窖酒糟，人為接種了釀造特香型白酒的特有微生物，調(diào)節(jié)曲坯的初始pH 值，使有益菌在固態(tài)發(fā)酵初期即處于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)地位，具有明顯的特色。雖然之前從特香型大曲中分離到一些微生物菌株，但目前還沒(méi)有鑒定出代謝產(chǎn)生特香型大曲曲香和特香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的菌種，影響特香型白酒品質(zhì)的關(guān)鍵微生物還未確定。

本試驗(yàn)從特香型大曲火圈層中分離篩選出1株具有水解淀粉活性的耐高溫細(xì)菌菌株，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定和基因序列同源性分析對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定，檢測(cè)了其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，并測(cè)定了其液態(tài)發(fā)酵的淀粉酶活力。本研究為進(jìn)一步研制強(qiáng)化大曲提供了菌種資源，同時(shí)為揭示功能細(xì)菌影響特香型大曲品質(zhì)的機(jī)理提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

特香型大曲曲塊取自四特酒有限責(zé)任公司大曲生產(chǎn)曲房。

1.1.2 儀器設(shè)備

滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、中藥粉碎機(jī)、渦旋混勻儀、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀、掃描電子顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、冷凍高速離心機(jī)、PCR 儀、凝膠成像儀、Agilent 7890A 氣相色譜儀配備5975C質(zhì)譜儀。

1.1.3 試劑和培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和普通生化試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。PCR 擴(kuò)增所用引物由湖南擎科生物公司合成。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉2.0，牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0～7.2。

LB 培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉5.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，KHPO2.0，MgSO·7HO 0.5，CaCl0.2，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐高溫細(xì)菌菌株的分離

選擇四特酒大曲生產(chǎn)曲房的優(yōu)質(zhì)出房曲，用中藥粉碎機(jī)將曲塊的火圈層粉碎，稱取2.0 g粉碎后的大曲于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 滅菌生理鹽水，封口后將樣品置于37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩30 min即得大曲懸液。將大曲懸液置于水浴鍋中，55 ℃水浴處理2 d。取1 mL 處理后的大曲懸液，用無(wú)菌生理鹽水將大曲懸液進(jìn)行梯度稀釋。將10到10稀釋度的大曲懸液各吸取100 μL 到LB 固體平板上涂布均勻，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行，待懸液充分吸收后倒置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 耐高溫解淀粉細(xì)菌菌株的篩選

將LB 平板上的耐高溫細(xì)菌單菌落點(diǎn)接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后將平板用盧戈氏碘液染色，選取菌落周?chē)型该魅Ξa(chǎn)生的單菌落作為解淀粉細(xì)菌初篩菌株。復(fù)篩時(shí)隨機(jī)選取每個(gè)初篩菌株的3 個(gè)單菌落分別測(cè)量透明圈直徑（H）和菌落直徑（C），根據(jù)兩者比值的平均值大小初步確定初篩菌株淀粉水解酶活性的高低，挑取淀粉水解活性最大的單菌落進(jìn)行純種分離、斜面培養(yǎng)并編號(hào)保藏。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將分離到的具有淀粉水解活性的耐高溫細(xì)菌菌株進(jìn)行平板劃線，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落的形態(tài)特征，取單菌落培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。

掃描電子顯微鏡制片及觀察：挑取培養(yǎng)平板上的細(xì)菌單菌落均勻涂于滴有蒸餾水的蓋玻片上并在酒精燈火焰上方烘干，然后把蓋玻片置于2.5 %的戊二醛磷酸緩沖液（pH7.0）中4 ℃固定過(guò)夜，取出蓋玻片用0.15 %的戊二醛磷酸緩沖液（pH7.0）沖洗殘余的戊二醛，再依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水。然后用乙醇-叔丁醇溶液（V/V=1∶1）和100 %叔丁醇置換乙醇，將蓋玻片進(jìn)行干燥處理。蓋玻片經(jīng)離子濺射儀噴鍍后在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)獲得的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。

1.2.3.3 細(xì)菌總DNA提取和基因擴(kuò)增

細(xì)菌總DNA 的提?。簩⒈２氐木昶桨鍎澗€活化后挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體。菌體基因組DNA 用Solarbio Bacteria DNA Kit 提取，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR 擴(kuò)增采用擴(kuò)增芽孢桿菌基因的通用引物UP-1:5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'和UP-2r:5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性1.5 min，反應(yīng)30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3.4 gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的結(jié)果，將目的條帶用Solarbio DNA Extraction Kit 回收，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR 目的條帶的回收產(chǎn)物送擎科生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列拼接后用NCBI 在線工具Blast在Gene Bank 內(nèi)與已公布其他細(xì)菌基因序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)Bootstraps法檢測(cè)1000次。

1.2.4 發(fā)酵上清液淀粉酶活的測(cè)定

將菌株單菌落接種到裝有50 mL LB 培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，以37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以2 %(v∶v)的接種量接種到裝有50 mL 產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中并在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)60 h。取不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液，4 ℃下以6000 r/min離心10 min，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾獲得發(fā)酵上清液，然后以DNS 法對(duì)上清液的淀粉酶活力進(jìn)行測(cè)定。在40 ℃、pH5.6的條件下，以每分鐘水解底物可溶性淀粉生成1 μmol 還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.5 菌體生物量的測(cè)定

取與上述測(cè)定發(fā)酵上清液淀粉酶活同批次、相同培養(yǎng)時(shí)間的菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)定經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液在600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值，以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 模擬大曲固態(tài)發(fā)酵

參照文獻(xiàn)模擬大曲制作工藝，采用市售普通小麥和麥粉，用蒸熟小麥粒（麥粒∶麥粉=1∶1，與等量水混合浸泡過(guò)夜、蒸熟）作為大曲固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。每150 mL 錐形瓶中裝入30 g 麥粒固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min。將保藏的菌株平板劃線活化后挑取單菌落接種于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)18 h，按2%的比例接種于麥粒固體培養(yǎng)基中。按照37 ℃，48 h；45 ℃，48 h；55 ℃，48 h的溫度調(diào)節(jié)程序在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后分析模擬大曲的揮發(fā)性香氣組分。

1.2.7 揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

采用固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（SPEGC-MS）對(duì)固態(tài)發(fā)酵后模擬大曲的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析。用脂肪酸型萃取針置于三角瓶中發(fā)酵麥粒培養(yǎng)基上方0.5 cm處萃取20 min。萃取完畢后將萃取頭插入GC 進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸3 min。氣相色譜條件：采用Agilent 7890A/5975C 型氣質(zhì)聯(lián)用儀，毛細(xì)管柱為DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），自動(dòng)不分流進(jìn)樣，流動(dòng)相為He，流速1 mL/min。進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度為250 ℃；柱溫程序?yàn)?5 ℃保持2 min，以2 ℃/min 的速率升溫到85 ℃，然后以8℃/min 升溫到250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：采用EI（Electron Impact Ionization）離子源，電子轟擊能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30～450 u。用NIST 11 譜庫(kù)對(duì)色譜峰進(jìn)行檢索定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫解淀粉細(xì)菌菌株ZRF-1的分離

為了從特香型白酒大曲中分離篩選具有水解淀粉活性的耐高溫細(xì)菌菌株，將55 ℃高溫處理2 d的四特酒大曲懸液梯度稀釋后在LB 平板上50 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。將獲得的耐高溫細(xì)菌單菌落點(diǎn)接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后將平板用盧戈氏碘液染色，選取菌落周?chē)型该魅Ξa(chǎn)生的菌株作為初篩菌株。

進(jìn)一步將初篩菌株分別點(diǎn)接種3 個(gè)單菌落于淀粉篩選平板上，通過(guò)比較淀粉水解透明圈直徑和菌落直徑的比值，篩選到淀粉水解活性相對(duì)最大的一種細(xì)菌菌株，編號(hào)為ZRF-1。圖1 所示為ZRF-1菌株在篩選培養(yǎng)基上的淀粉水解透明圈。

圖1 ZRF-1菌株的淀粉水解圈圖

2.2 耐高溫解淀粉菌株ZRF-1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將ZRF-1菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，如圖2 所示，37 ℃培養(yǎng)24 h 的ZRF-1 菌株菌落顏色為淡黃色半透明，黏稠呈蠟油狀，表面濕潤(rùn)有光澤，邊緣光滑，單菌落形狀不規(guī)則。ZRF-1 菌株的革蘭氏染色結(jié)果顯示菌體細(xì)胞被均勻染成紫色，確定ZRF-1 菌株為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。如圖3 所示，從掃描電子顯微鏡的形態(tài)觀察結(jié)果來(lái)看，ZRF-1 菌株的細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，菌體細(xì)胞直徑為0.5～0.7 μm，長(zhǎng)度為1.5～2.5 μm，確定ZRF-1細(xì)菌菌株為桿菌。

圖2 ZRF-1菌株的菌落形態(tài)圖

圖3 ZRF-1菌株的掃描電鏡圖

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

如表1 所示，生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZRF-1 菌株酪蛋白水解和VP 試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，最高耐鹽濃度為10%，對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇等的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，ZRF-1 菌株的生理生化特性與革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌屬細(xì)菌一致，初步確定ZRF-1菌株為芽孢桿菌類(lèi)細(xì)菌。在50 ℃恒溫?fù)u床液體培養(yǎng)條件下和50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)條件下，ZRF-1 菌株均能夠正常生長(zhǎng)，證明ZRF-1菌株為耐熱芽孢桿菌。

表1 ZRF-1菌株的生理生化特征

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌中有許多在進(jìn)化過(guò)程中保守的，且基因序列的變異速度比16S rDNA 基因快的功能基因。在大多數(shù)細(xì)菌中都存在的DNA 促旋酶(gyrase)中B 亞單位基因是這一類(lèi)基因的典型代表。與可以從屬水平上鑒定細(xì)菌的16S rDNA 基因相比，基因在近緣種和種以下分類(lèi)單元的鑒定方面更具優(yōu)越性。因此本試驗(yàn)選用gyrB 基因鑒定ZRF-1菌株的屬種。

以ZRF-1 菌株的基因組DNA 為模板，采用擴(kuò)增芽孢桿菌gyrB 基因的通用引物UP-1 和UP-2r進(jìn)行PCR 反應(yīng)，得到大小約為1.2 kbp 的特異性條帶（圖4）。測(cè)序結(jié)果顯示ZRF-1 菌株的基因序列為1,188 bp。將此序列用NCBI 在線工具Blast同Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇其中的16 株標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因參考序列，采用MEGA10.0 軟件，用Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖4 所示，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，ZRF-1 菌株與多株地衣芽孢桿菌（）聚集為一支。

圖4 ZRF-1菌株gyrB基因擴(kuò)增電泳圖及基于gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

基于基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果，可以確定ZRF-1 菌株為地衣芽孢桿菌，命名為ZRF-1。

2.3 菌株ZRF-1的生長(zhǎng)曲線與淀粉酶合成規(guī)律

由于芽孢桿菌分泌的淀粉酶大多為胞外酶，將ZRF-1 菌株單菌落接種到產(chǎn)淀粉酶液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min 的搖瓶發(fā)酵條件下培養(yǎng)60 h，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體生物量和發(fā)酵上清液的淀粉酶活力繪制ZRF-1 菌株的生長(zhǎng)曲線，同時(shí)探究ZRF-1菌株搖瓶發(fā)酵的淀粉酶合成規(guī)律。

由圖5 可知，菌株ZRF-1 在搖瓶發(fā)酵的1～2 h快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在20 h 菌體濃度達(dá)到最大值。ZRF-1 菌株產(chǎn)淀粉酶活力在對(duì)數(shù)后期14 h 后快速增長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期后ZRF-1菌株產(chǎn)淀粉酶活力高且較穩(wěn)定，說(shuō)明ZRF-1菌株產(chǎn)淀粉酶活力的大小與菌體的生長(zhǎng)基本呈正相關(guān)。進(jìn)入衰亡期52 h 后ZRF-1 菌株產(chǎn)淀粉酶活力仍有一定程度的增長(zhǎng)，推測(cè)ZRF-1菌株發(fā)酵前期分泌的淀粉酶活性仍較高。

圖5 ZRF-1菌株的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶量

2.4 ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味化合物活性分析

利用分離自特香型大曲火圈層的ZRF-1 菌株通過(guò)37 ℃，48 h；45 ℃，48 h；55 ℃，48 h 的溫度調(diào)節(jié)程序在培養(yǎng)箱中進(jìn)行了模擬大曲固態(tài)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的主要揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖6 和表2 所示。ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生3-羥基二丁酮（乙偶姻）、[S-(R*,R*)]-2,3-丁二醇、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和四甲基吡嗪等揮發(fā)性風(fēng)味化合物。乙偶姻在ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中的相對(duì)含量最高，其次是2,3-丁二醇和四甲基吡嗪等吡嗪類(lèi)風(fēng)味化合物。

表2 ZRF-1菌株及空白實(shí)驗(yàn)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相對(duì)含量

圖6 菌株ZRF-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味化合物的GC-MS分析色譜圖

3 討論

耐熱和嗜熱微生物是中高溫白酒大曲中重要的優(yōu)勢(shì)功能菌。白酒大曲功能菌株與大曲中各種酶系的產(chǎn)生、大曲曲香的形成以及白酒特征風(fēng)味物質(zhì)的形成之間有著緊密的聯(lián)系。本研究從中高溫特香型大曲火圈層中分離篩選到1 株具有水解淀粉活性的耐高溫細(xì)菌菌株ZRF-1 并結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定的方法將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌菌株。

大曲微生物產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶等酶系在大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中降解底物并產(chǎn)生風(fēng)味化合物或風(fēng)味前體化合物。在利用產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基對(duì)ZRF-1菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，從對(duì)數(shù)后期到穩(wěn)定期直到衰亡期前期ZRF-1 菌株產(chǎn)生的淀粉酶活力一直不斷增高且較穩(wěn)定。說(shuō)明ZRF-1 菌株產(chǎn)淀粉酶活力的大小與菌體的生長(zhǎng)基本呈正相關(guān)，而且可以推測(cè)ZRF-1菌株分泌的淀粉酶穩(wěn)定性較好，不會(huì)隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行而快速失活。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步克隆ZRF-1 菌株的淀粉酶基因，進(jìn)行異源表達(dá)和純化，挖掘潛在的淀粉酶資源。

芽孢桿菌在白酒釀造過(guò)程中除了分泌多種水解酶，同時(shí)能夠產(chǎn)生重要的白酒特征風(fēng)味物質(zhì)。大量存在于高溫大曲中的芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物經(jīng)高溫條件產(chǎn)生的香味物質(zhì)與醬香味有密切關(guān)系。例如從郎酒大曲中分離到的3 株大量產(chǎn)生四甲基吡嗪等吡嗪類(lèi)及其前體化合物乙偶姻。張榮等從醬香型高溫大曲中篩選到3 株地衣芽孢桿菌并在其純培養(yǎng)發(fā)酵液中檢測(cè)到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾。本研究利用ZRF-1 菌株模擬大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)分析固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性化合物組分發(fā)現(xiàn)ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生相對(duì)含量占85.86%的乙偶姻。乙偶姻是吡嗪環(huán)的前驅(qū)物，也是四甲基吡嗪最可能的前驅(qū)物。目前在醬香型白酒中檢測(cè)出較高濃度的吡嗪類(lèi)風(fēng)味化合物，其中四甲基吡嗪的含量最高。本研究檢測(cè)到四甲基吡嗪在ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物中相對(duì)含量達(dá)到3.45 %，也是遠(yuǎn)高于2,3,5-三甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪等其他吡嗪類(lèi)風(fēng)味化合物的相對(duì)含量。除此之外還檢測(cè)到相對(duì)含量占比達(dá)到8.61%的2,3-丁二醇，2,3-丁二醇是酒類(lèi)中極少數(shù)呈香的多元醇之一，產(chǎn)生像黃油和奶油的香氣。優(yōu)質(zhì)特香型大曲隨著固態(tài)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行逐漸產(chǎn)生清晰的大曲外皮、火圈層和大曲核心三層結(jié)構(gòu)，其中火圈層明顯的特香型大曲具有顯著的醬香味，而ZRF-1菌株分離自特香型大曲的火圈層，因此推測(cè)ZRF-1菌株參與特香型大曲曲香的形成，進(jìn)一步可能對(duì)特香型白酒風(fēng)味的形成產(chǎn)生一定的作用。

本研究從特香型大曲火圈層中分離篩選到1株具有水解淀粉活性的耐高溫地衣芽孢桿菌菌株，鑒定出其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，并驗(yàn)證了該菌株液態(tài)發(fā)酵純培養(yǎng)的淀粉酶活力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)對(duì)地衣芽孢桿菌ZRF-1菌株的耐熱、產(chǎn)酶和產(chǎn)香特性做進(jìn)一步的研究。本研究豐富了中高溫大曲中產(chǎn)淀粉酶功能菌的菌種資源，為進(jìn)一步研制強(qiáng)化大曲將其投入到實(shí)際應(yīng)用中提供了一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為揭示功能細(xì)菌與特香型大曲曲香的形成以及特香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成之間的關(guān)系提供了一定的科學(xué)依據(jù)。