堿基編輯器新載體安全又高效

編譯 希區(qū)客

如果你是一個航天發(fā)燒友，同時又緊跟CRISPR的動態(tài)，那么你或許會把這兩個領(lǐng)域的新晉“頂流”——火星登陸的毅力號和體內(nèi)注射的堿基編輯——組成“CP”，因為它倆從某種層面上看是非常相像的。

毅力號探測器乘坐火箭升空，之后依靠自身的巡航、下降和減速系統(tǒng)完成火星軟著陸，隨即開始在目標(biāo)區(qū)域活動，并借助多種相機、分析儀、成像儀、光譜儀等裝備尋找生命的跡象。CRISPR系統(tǒng)通過注射進入機體，之后靠著遞送載體保駕護航行至目標(biāo)細胞，載體隨即釋放堿基編輯工具，細胞內(nèi)的基因編輯工作由此開始。

對于毅力號來說，從時速2萬公里變?yōu)?的著陸過程是極具挑戰(zhàn)性的“恐怖7分鐘”。而對于基因/堿基編輯系統(tǒng)而言，從進入生物體到開始編輯的整個過程都是不可見又不可控的“恐怖時間”。

火星登陸成不成，仰仗著陸系統(tǒng)的能耐；堿基編輯好不好，指望遞送載體的水平。如果我們想讓體內(nèi)注射形式的基因治療真正發(fā)揮作用，設(shè)計出更智能、更高效的遞送載體是關(guān)鍵。

近期，由劉如謙（David Liu）博士領(lǐng)導(dǎo)的哈佛團隊推出了新一代（第四代）的“工程化類病毒顆粒”載體（eVLP）。該團隊于2022年1月發(fā)表在《細胞》（Cell）上的研究顯示，這些氣泡狀的eVLP能將CRISPR和堿基編輯組件傳送至各類器官和組織。相比于前三代載體，新版eVLP以更高的效率抵達目標(biāo)，釋放組件，編輯細胞，且副作用極小。（所謂“類病毒顆?！笔遣《镜鞍椎慕M裝體不具備病毒的遺傳物質(zhì)，換言之，eVLP載體只擁有病毒的軀殼，卻沒有病毒的靈魂。）

新成果包含了3個關(guān)鍵的概念驗證試驗：研究團隊借助有eVLP加持的堿基編輯系統(tǒng)，成功恢復(fù)了遺傳性失明小鼠的視力，關(guān)閉了小鼠肝臟中與高膽固醇水平相關(guān)的突變基因，修復(fù)了小鼠大腦內(nèi)的缺陷基因。

第四代eVLP如同一艘功能強勁的分子飛船，載著基因修改器，駕輕就熟地進入視網(wǎng)膜組織，失明小鼠在完成單次注射后的短短5周內(nèi)就獲得了視力。小鼠的肝臟和大腦組織存在防御屏障，尤其大腦的屏障非常牢固，但eVLP還是攻堅成功，準(zhǔn)確送達——單次注射降低了肝臟突變基因?qū)е滦呐K和神經(jīng)損傷的風(fēng)險，而進入腦細胞的編輯工具有大約50%的機會改變?nèi)毕莼颉?/p>

更令人贊嘆的是，eVLP是一個“即插即用”的平臺：通過改變目標(biāo)組件，理論上它可以抵達身體的任何地方。

劉如謙指出：“我們非常需要一種更好的方法來將蛋白質(zhì)輸送到生命體的各種組織中。我們希望這些eVLP不僅能用于傳遞堿基編輯工具，還可運載其他的蛋白質(zhì)?！?/p>

生物技術(shù)公司Verve Therapeutics的聯(lián)合創(chuàng)始人兼首席執(zhí)行官塞卡·凱瑟瑞桑（Sekar Kathiresan）博士表示：“總的來說，劉博士及其同事在基因編輯工具的遞送方面取得了令人激動的新進展?！保▌P瑟瑞桑并未參與新研究。）

堿基編輯器-遞送載體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖

智能運送官

我們已經(jīng)擁有一系列出色的基因編輯器，但一直缺少高效的運送者。

所謂的堿基編輯是CRISPR的一種變體，以其極致的精確性而風(fēng)靡行業(yè)。與傳統(tǒng)的CRISPR類似，堿基編輯工具有兩大組成部分：負責(zé)尋找目標(biāo)基因的向?qū)NA，以及負責(zé)替換單個堿基（A、G、C、T）的Cas蛋白。不過堿基編輯不像Cas9“魔剪”那般剪斷DNA雙鏈，因此它更少犯錯，有望成為治療數(shù)百種遺傳疾病的終極方案。

病毒長期以來都是研究人員首選的遞送載體，因為它們具有感染細胞的能力?？茖W(xué)家會消除病毒引發(fā)疾病的能力，與此同時，又利用它攜帶堿基編輯器的編碼序列的本領(lǐng)。載體一旦進入細胞，其中的編碼序列就會表達蛋白質(zhì)。細胞因此能夠產(chǎn)生自己的堿基編輯工具。劉如謙團隊和其他科學(xué)家此前都利用過腺相關(guān)病毒（AAE）將編碼堿基編輯器的DNA遞送至靶組織。

研究團隊利用eVLP將體內(nèi)基因治療工具包送往小鼠的視網(wǎng)膜、肝臟和大腦

但這種方式并非最佳。一方面，我們知道堿基編輯器的核心功能部件是負責(zé)轉(zhuǎn)化堿基（C→U）的脫氨酶，以及能與目標(biāo)DNA結(jié)合的Cas蛋白。將這些蛋白質(zhì)以DNA序列的形式導(dǎo)入目標(biāo)然后再表達繼而開展編輯（借助核轉(zhuǎn)染技術(shù)），整個過程更加漫長，增加了脫靶頻率。另一方面，病毒載體雖然高效，但會導(dǎo)致細胞超速運轉(zhuǎn)，產(chǎn)生過多堿基編輯器，加重細胞負擔(dān)，帶來副作用。此外，病毒也有可能通過進入基因組本身而破壞基因完整性，引發(fā)癌癥風(fēng)險。

鑒于上述種種，我們是不是可以設(shè)計出一類取病毒之精華而去病毒之糟粕的“仿”病毒載體，直接帶著堿基編輯器而非其編碼序列，奔赴目的地呢？

新eVLP，新世界

只有病毒軀殼而沒有病毒DNA的eVLP就是這一思路下的典范作品。它不會造成真正的感染，卻又能像真病毒一樣快速有效地“感染”細胞，且裝載的是編輯工具，沒有細胞內(nèi)“再表達”環(huán)節(jié)。

當(dāng)然，它也存在不足之處，那就是遞送精準(zhǔn)度很糟糕：舊版本（前三代）的eVLP有時候會像一艘歸航系統(tǒng)失控的飛船，撞向其他行星并引發(fā)意想不到的災(zāi)難；它也不擅長“到點卸貨”，編輯器有時明明已經(jīng)抵達目的地了，卻被鎖在載體內(nèi)無法釋放，這讓整個基因編輯工作失去了意義。

而劉如謙等人所做的工作就是彌補老eVLP的短板。他們分析發(fā)現(xiàn)，如果限制在eVLP內(nèi)充當(dāng)載體“安全帶”的蛋白質(zhì)的數(shù)量，“貨物”會更容易被釋放；此外，貨物的包裝方式也會影響其釋放。安全帶和貨物之間的平衡似乎是既保證貨物安全又能助其在目的地順利釋放的關(guān)鍵。另一方面，在eVLP的外層修飾特定的蛋白質(zhì)有助于它抵達目標(biāo)器官。

劉如謙表示：“我們知道了一些eVLP的關(guān)鍵瓶頸，以及解決它們的方法。雖然我們必須為一種不尋常的蛋白質(zhì)貨物開發(fā)新版本的eVLP載體，但是我們可以高效地完成這項工作。”

工作的成果是喜人的，新載體所能包裝的貨物量是老版eVLP的16倍，新工具的編輯效率比過去提高了26倍。

如研究團隊事先所預(yù)期的，四代eVLP幾乎不受脫靶效應(yīng)的困擾。他們檢測了DNA水平和RNA水平的脫靶情況，發(fā)現(xiàn)eVLP相比于病毒或其他質(zhì)粒載體，幾乎不會發(fā)生脫靶現(xiàn)象。

劉如謙團隊計劃未來開發(fā)更優(yōu)質(zhì)的“安全帶”蛋白質(zhì)，為載體內(nèi)的“貨物”提供更好的服務(wù)。這些貨物可以是基因編輯器，也可以是胰島素或用于癌癥免疫治療的蛋白質(zhì)等。此外，他們還將進一步解析 eVLP，探索它在人體內(nèi)的更多可能，并嘗試研發(fā)更新型的載體。

資料來源singularityhub.com