無償獻血者ELISA-NAT+標本核酸鑒別/拆分結(jié)果研究

李沖 肖改娥 王儒意 張博 李宏

(1.陜西省商洛市中心血站檢驗科,陜西 商洛 726100;2.西安市中心醫(yī)院檢驗科,陜西 西安 710003;3.安康市人民醫(yī)院檢驗科,陜西 安康 725000;4.陜西省安康市中心血站檢驗科,陜西 安康 725000)

目前，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行病毒抗原或抗體的檢測是采供血機構普遍采用的篩查策略，隨著試劑靈敏度的不斷提高，經(jīng)輸血傳播病毒的風險已降至很低，但由于免疫學方法的局限性，漏檢的現(xiàn)象仍會發(fā)生，使臨床用血安全存在隱患[1-2]。因此，越來越多的采供血機構開始在血液篩查中引入核酸擴增檢測技術(NAT)。我國從2010年開展血站核酸檢測試點工作，2012版血站技術操作規(guī)程開始把核酸檢測技術納入血液篩查策略，鼓勵有條件的地區(qū)和單位率先開展核酸檢測[3-4]。本文用NAT對兩種ELISA試劑檢測乙型肝炎病毒(HBV)標志物后陰性的標本進行核酸檢測及鑒別試驗，并對兩種ELISA試劑檢測結(jié)果進行整理和分析，為采供血機構同行選擇HBV感染標志物檢測策略提供一些參考建議。報告如下。

1 資料與方法

1.1血液樣本 隨機抽取2017年6月至2019年6月本實驗室收集的120份無償獻血者血液標本，獻血者均經(jīng)獻血車金標試紙條快速法初篩合格。每位獻血者留取2管樣本，分別為5 mL的EDTA K2真空采血管(滄州永康)和5 mL的EDTA K2離膠真空采血管(美國BD)，其中不含分離膠的采血管用于ELISA檢測，含有分離膠的用于NAT檢測。NAT管在采集后4 h內(nèi)離心，各項檢測及拆分鑒別實驗在標本采集后72 h內(nèi)完成。ELISA HBsAg檢測為：初檢儀器，Tecan公司FreedomEVO前加樣系統(tǒng)，西門子公司BEPⅢ酶免后處理系統(tǒng)。復檢儀器：Tecan公司FreedomEVO前加樣系統(tǒng)，Ausbio公司FAME24/20酶免后處理系統(tǒng)。試劑：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，生產(chǎn)廠家分別為：北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司(以下簡稱北京萬泰)，批號：B20161030、B20170628、B20180517、B20180831；英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司(以下簡稱廈門新創(chuàng))，批號：2016115132、2017095126、2018065121、2018085128。質(zhì)控品：北京康徹思坦公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清(液體)標準物質(zhì)。NAT檢測為：儀器，羅氏COBAS201核酸檢測系統(tǒng)(美國Roche)；試劑：羅氏公司乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人類免疫缺陷病毒(1+2型)檢核酸試劑(PCR-熒光法)(Procleix UltrioAssay)。質(zhì)控品：北京康徹思坦公司生產(chǎn)的適用于羅氏二代混檢系統(tǒng)的血篩核酸混合(HBVDNA/HCVRNA/HIV -1RNA)(液體)標準物質(zhì)。以上所有使用的試劑均檢查合格且在試劑有效期內(nèi)使用；所有的儀器均按儀器說明書的要求進行保養(yǎng)和維護，并確保儀器在正常工作狀態(tài)下運行。

1.2方法 (1)ELISA HBsAg檢測：將樣本管按要求進行離心，ELISA試劑、質(zhì)控品平衡至室溫。用兩臺FreedomEVO前加樣系統(tǒng)使用一次性加樣針進行全自動加樣，再分別采用BEPⅢ酶免后處理系統(tǒng)和FAME24/20酶免后處理系統(tǒng)進行后續(xù)處理。即ELISA兩種試劑使用不同的加樣系統(tǒng)，不同的分析系統(tǒng)同時檢測，按各試劑的檢測標準操作規(guī)程進行操作。ELISA兩種試劑均無反應性的樣本判定為HBsAg陰性，兩種試劑均有反應性的樣本判定為HBsAg陽性；只有單一種ELISA試劑有反應性的樣本需進行原試劑雙孔復試，復試雙孔中有一孔或雙孔有反應性的樣本判定為HBsAg陽性，否則判定為HBsAg陰性。(2)單人份核酸檢測：酶免檢測完成后，對照檢測結(jié)果挑選并剔除酶免為陽性結(jié)果的核酸樣本之后其余樣本做核酸檢測。將核酸檢測試劑、質(zhì)控品按要求平衡至室溫。將含有EDTAK2分離膠的真空采血管按要求進行離心，使用羅氏COBAS201系統(tǒng)，羅氏核酸檢測試劑進行6混樣模式檢測，混檢有反應性的pool再次進行單管拆分鑒別檢測，確定有反應的是哪個樣本管及HIV1RNA、HCVRNA、HBV DNA具體的反應性項目。無反應性的標本為NAT陰性，有反應性的標本為NAT陽性。 (3)觀察指標：(1)比較NAT與ELISA的HBsAg檢測結(jié)果。(2)比較NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況。(3)統(tǒng)計10份NAT(+)HBsAg單試劑陽性樣本中北京萬泰試劑與廈門新創(chuàng)試劑S/CO并對比。

2 結(jié) 果

2.1NAT與ELISA的HBsAg檢測結(jié)果對比 在120份樣本NAT與 ELISA HBsAg 檢測結(jié)果中，NAT檢測與ELISA檢測一致，其中NAT檢測NAT(+)17份，包括：ELISA HBsAg(+)10份、(-)7份，ELISA檢測HBsAg(+)17份，包括：NAT(+)10份、NAT(-)樣本7份。見表1。

表1 NAT與ELISA的HBsAg檢測結(jié)果對比[n=120，n(%)]

2.2NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況與S/CO比對結(jié)果 北京萬泰單一ELISA試劑陽性數(shù)更高，在ELISA HBsAgS/CO上與廈門新創(chuàng)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況

表3 單試劑陽性樣本中北京萬泰試劑與廈門新創(chuàng)試劑S/CO比對結(jié)果

3 討 論

NAT在我國采供血機構中仍處于起步階段，但在血液篩查中的應用具有重要意義[5]。相比臨床而言，對試劑靈敏度的要求更高，因采供血機構的檢測目的是為了獲得安全的血液，主要強調(diào)的是試劑的靈敏度和特異性，并且對實驗室的規(guī)范操作要求更高[6-7]。NAT是一系列直接檢測病毒核酸技術的總稱[8]。主要原理是使用一些物理、化學和生物學方法，通過靶位核酸直接擴增或擴增其附帶信號的方法，讓看不見的極微量的核酸變成直觀的光電和可視信號，從而判斷標本中是否存在相應的病原體[9-10]。

s本次研究結(jié)果表明，在120份樣本NAT與 ELISA HBsAg檢測結(jié)果中，NAT檢測與ELISA檢測一致，其中NAT檢測NAT(+)17份，包括：ELISA HBsAg(+)10份、(-)7份，ELISA檢測HBsAg(+)17份，包括：NAT(+)10份、NAT(-)樣本7份。在 HBsAg(-)的血液中檢出 HBV-DNA(+)，說明血液存在著 HBV-DNA 在復制，病人輸入這樣的血液后有感染HBV的風險。NAT檢測可以檢出處在HBsAg感染的窗口期、隱匿性HBV感染、HBV變異等導致HBsAg表達抑制，或結(jié)構改變等因素使HBsAg不能被檢出，但HBV-DNA在呈低水平的復制血液。7份HBsAg(+)NAT(-)的樣本由于沒有進行中和試驗等其它確證試驗，存在HBsAg假陽性的可能，也有可能是血液中存在的HBV DNA含量在核酸檢測靈敏度之下而造成結(jié)果陰性，或機體的長期病毒感染導致血液中抗原滴度很高，不影響HBsAg的檢出，但血液中存在的HBsAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達所致，所以檢測不到血清中病毒HBV-DNA。北京萬泰單一ELISA試劑陽性數(shù)更高，在ELISA HBsAgS/CO上與廈門新創(chuàng)相比存在顯著差異，說明兩者的靈敏度有差異。另外北京萬泰試劑和廈門新創(chuàng)試劑在HBsAg亞型及變異HBsAg的檢測中，北京萬泰試劑對HBV亞型最低檢出量的檢出能力強、靈敏度高，兩種試劑在adradway亞型的最低檢出量有顯著性差異。

綜上所述，NAT方法和ELISA方法在HBV感染標志物的檢測結(jié)果中有明顯的差別，單獨使用兩種方法中的一種存在著漏檢的可能。核酸檢測在一定程度上可以彌補ELISA的漏檢情況。兩種HBsAg檢測試劑中北京萬泰試劑與廈門新創(chuàng)試劑之間存在著差異，北京萬泰HBsAg試劑檢出率明顯高于廈門新創(chuàng)HBsAg試劑。