荸薺皮多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性

曾凡珂，潘蕾蔓，張祎，賴富饒，吳暉，張猛猛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

荸薺（Eleocharis dulcis）也稱(chēng)作馬蹄、鳧茈和水栗等，屬于莎草科（Cyperaceae）水生植物[1]，生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是中國(guó)南方地區(qū)的重要作物，在廣東和廣西一帶廣泛分布，通常指該植物的可食用部位，也就是它的地下球莖。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)荸薺的年均產(chǎn)量超過(guò)1.0×106t，荸薺可用來(lái)生食、做菜肴或是生產(chǎn)淀粉。荸薺加工的副產(chǎn)物荸薺皮占到整個(gè)荸薺球莖質(zhì)量的20%左右，但在食品加工后通常被廢棄或者充當(dāng)飼料，經(jīng)濟(jì)附加值低。

多糖可發(fā)揮抗氧化、抑菌、抗炎和提高免疫力等多種生物活性，并且具有親水性強(qiáng)、熱穩(wěn)定和粘度較大等特性，因此在化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景[2]。水溶性多糖也是荸薺皮的重要組成成分，但目前對(duì)荸薺皮多糖的研究較少，尤其是對(duì)其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的研究還很缺乏，活性方面也只有關(guān)于荸薺皮粗多糖的抗氧化活性研究。本實(shí)驗(yàn)室前期已從荸薺皮中分離純化出兩種純化的多糖組分 WVP-1和WVP-2，并對(duì)二者的結(jié)構(gòu)和直接清除自由基的能力進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，WVP-1中可能同時(shí)含有線型和分支型多糖分子，且具有類(lèi)似支鏈淀粉的葡聚糖分子，WVP-2為一種含有同型半乳糖醛酸聚糖（HG）結(jié)構(gòu)的低糖醛酸、果膠類(lèi)似物。二者均具有氧自由基吸收能力（ORAC）[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)探究WVP-1和WVP-2的晶體特性、熱穩(wěn)定性、Zeta電位和粘度這些理化性質(zhì)，測(cè)定出 WVP-2的酯化度，并基于細(xì)胞抗氧化和紅細(xì)胞溶血模型進(jìn)一步探究荸薺皮純化多糖的抗氧化能力。該研究結(jié)果可為充分開(kāi)發(fā)利用荸薺皮資源，開(kāi)發(fā)新型多糖類(lèi)產(chǎn)品提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺皮收集自五山市場(chǎng)，荸薺的產(chǎn)地為廣東省韶關(guān)市樂(lè)昌市北鄉(xiāng)鎮(zhèn)；荸薺皮純化多糖組分WVP-1（中性多糖，純度95.03%，Mw=3.16 ku）和WVP-2（酸性多糖，純度91.61%，糖醛酸含量6.25%，Mw=56.97 ku），實(shí)驗(yàn)室自制；肝癌細(xì)胞 HepG2，實(shí)驗(yàn)室保存；2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH），上海源葉生物科技有限公司；2’,7’-二氯熒光二乙酸（DCFH-DA），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；抗凝羊血，廣州蕊特生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

X’pert Power X射線衍射儀，荷蘭帕納科公司；STA449F3同步熱分析儀，德國(guó)耐馳公司；Horibasz-100Z納米顆粒分析儀，日本HORIBA公司；Vertex傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó) Bruker公司；SuPerMax3100多功能酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 X射線衍射光譜（XRD）分析

參考易曉敏[4]的測(cè)定方法，WVP-1和WVP-2的晶體結(jié)構(gòu)由X射線衍射儀測(cè)得，測(cè)定條件為：BB聚焦光路，掃描速度為12 °/min，步長(zhǎng)為0.013 °，掃描范圍 2θ為 5 °～70 °。

1.3.2 熱特性分析

同步熱分析儀對(duì)WVP-1和WVP-2進(jìn)行熱重和差式掃描量熱分析。精確稱(chēng)取一定量的 WVP-1和WVP-2樣品，置于坩堝中，充入 N2，從 30 ℃以10 ℃/min的速率升到500 ℃。

1.3.3 Zeta電位測(cè)定

配制濃度為0.5 mg/mL的WVP-1和WVP-2溶液，目測(cè)可通過(guò)光，用納米顆粒分析儀測(cè)定 25 ℃下WVP-1和WVP-2的Zeta電位。

1.3.4 特性粘度測(cè)定

將楊蕙[5]的方法稍作修改，選擇毛細(xì)管內(nèi)徑為0.3～0.4 mm的烏氏粘度計(jì)測(cè)定WVP-1和WVP-2的特性粘度。WVP-1的測(cè)試濃度分別為4.00、7.69、11.11和14.29 mg/mL，WVP-2的測(cè)試濃度分別為0.60、1.15、1.67、2.14 mg/mL，按照下列公式計(jì)算相關(guān)粘度：

式中：

T1——蒸餾水流經(jīng)兩刻度線時(shí)間的平均值；

T2——各濃度多糖溶液流經(jīng)兩刻度線時(shí)間的平均值。

求出四個(gè)濃度下多糖溶液的各類(lèi)粘度，并以縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別為比濃粘度和多糖溶液濃度作圖，擬合出回歸直線與縱坐標(biāo)的截距即為WVP-1和WVP-2的特性粘度。

1.3.5 酯化度測(cè)定

WVP-2酯化度的確定借助紅外光譜法，紅外光譜儀中進(jìn)行波數(shù) 400～4000 cm-1范圍內(nèi)的掃描。采用Origin 2017對(duì)波數(shù)1730和1640 cm-1附近的特征吸收峰進(jìn)行分峰擬合，得到對(duì)應(yīng)的峰面積，就可計(jì)算出酯化度DE[6]：

式中：

A1640——1640 cm-1處的吸收峰面積；

A1730——1730 cm-1處的吸收峰面積。

1.3.6 細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)（CAA，Cellular Antioxidant Activity）

參考張猛猛[7]的方法。測(cè)定終濃度為 62.5～1000 μg/mL的WVP-1和WVP-2抑制AAPH誘發(fā)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的能力。

96孔板每孔加入100 μL 6×105cells/mL HepG2懸液，并在37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育1 d。1 d過(guò)后，去除上清液，用磷酸鹽緩沖溶液PBS清洗細(xì)胞數(shù)次。WVP-1或WVP-2培養(yǎng)液和DCFH-DA（50 μmol/L）混合，加入96孔板，孵育2 h。使用普通培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組。時(shí)間到后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS清洗，隨后每孔加入100 μL AAPH工作液（600 μmol/L），發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)分別為485 nm和535 nm，4 min記錄一次熒光強(qiáng)度，連續(xù)記錄1 h。每種樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

1.3.7 抑制AAPH誘發(fā)的紅細(xì)胞氧化溶血

參考孫崇臻[8]的方法。測(cè)定WVP-1和WVP-2對(duì)AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的抑制能力，WVP-1和WVP-2 的作用濃度均為 62.5～1000 μg/mL。

測(cè)定AAPH誘導(dǎo)的氧化溶血率的過(guò)程中，分為陰性對(duì)照組、AAPH組、樣品保護(hù)組、毒性對(duì)照組和全溶血組，各組均取200 μL的紅細(xì)胞懸液，分別與200 μL的PBS、不同濃度的多糖溶液和蒸餾水混合，37 ℃，180 r/min振蕩30 min后，分別加入400 μL的PBS、AAPH溶液和蒸餾水，37 ℃，180 r/min振蕩2 h，每管加入5 mL PBS，1200 r/min離心10 min。各組的試劑配方如表1所示。

表1 測(cè)定氧化溶血率的試劑配方Table 1 Reagent formula of the determination of hemolysis rate of oxidation

取上述各組的上清液200 μL于96孔板中，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm下的吸光值，各組溶血率的計(jì)算公式如下：

式中：

Aa——陰性對(duì)照組的吸光值；

Ab——AAPH組的吸光值；

Ac——樣品保護(hù)組的吸光值；

Ad——毒性對(duì)照組的吸光值；

Ae——全溶血組的吸光值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 14.0進(jìn)行顯著性差異分析，若p＜0.05，則視為差異顯著。采用Origin 2017和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺皮純化多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 X射線衍射光譜（XRD）分析

多糖分子可以通過(guò)其上豐富的羥基形成氫鍵，在分子內(nèi)和分子間產(chǎn)生連接，導(dǎo)致其呈現(xiàn)出不同程度的結(jié)晶排列以及無(wú)定型態(tài)和晶態(tài)之間的轉(zhuǎn)變[9]。不同的結(jié)晶程度會(huì)導(dǎo)致多糖分子的拉伸強(qiáng)度、溶解性、形變程度和溶脹特性有差異，多糖多以非結(jié)晶的無(wú)定型或半結(jié)晶形態(tài)存在[10]。結(jié)晶程度較高的多糖拉伸強(qiáng)度較大，易于成膜，因此可用于制備可食性薄膜，而無(wú)定型態(tài)多糖作為藥品或食品使用時(shí)，通常具有較好的溶解性和生物利用度，因此可用于開(kāi)發(fā)食品微膠囊[11]。本研究采用XRD分析了WVP-1和WVP-2的結(jié)晶形態(tài)，結(jié)果如圖1所示，在衍射角2θ范圍為5 °～70 °時(shí)，WVP-1和WVP-2衍射強(qiáng)度最高峰均出現(xiàn)在20.63 °左右，其峰形圓鈍，峰強(qiáng)度較低，因此WVP-1和WVP-2中結(jié)晶區(qū)域的比例較少，主要以無(wú)定型態(tài)存在[4]。竇勇博[12]報(bào)道白蘆筍下腳料多糖的XRD圖譜衍射峰主要集中在2θ為20 °～30 °范圍內(nèi)，峰形與荸薺皮多糖接近，結(jié)晶程度低，溶解性較好，因此用其開(kāi)發(fā)的速溶固體飲料品質(zhì)較好，這暗示著荸薺皮多糖可能也具有這方面的應(yīng)用價(jià)值。

2.1.2 熱特性分析

溫度的變化會(huì)對(duì)多糖的形態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響多糖在貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性以及加工性能。因此，本研究利用TG-DSC分析WVP-1和WVP-2的熱穩(wěn)定性。玻璃化溫度Tg為玻璃態(tài)和高彈態(tài)相互轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度，是物質(zhì)發(fā)生軟化前的最高溫度，而熱分解溫度對(duì)應(yīng)分子中氫鍵、C-O鍵和C-C鍵斷裂速度最快時(shí)的溫度[13]。如圖2所示，在30～500 ℃的溫度范圍內(nèi)，荸薺皮多糖WVP-1和WVP-2的質(zhì)量和熱量變化主要經(jīng)歷兩個(gè)階段。WVP-1的第一階段為28.08～ 160.38 ℃，溫度拐點(diǎn)即Tg為61.30 ℃，WVP-2的第一階段為28.38～121.08 ℃，Tg為69.50 ℃，對(duì)應(yīng)DSC曲線中的一個(gè)吸熱峰。WVP-1和WVP-2的Tg高于常溫，可見(jiàn)WVP-1和WVP-2在常溫下均能維持在玻璃態(tài)，在貯藏過(guò)程中可保持穩(wěn)定。由TG曲線可知，WVP-1在第一階段的質(zhì)量損失為9.67%，而WVP-2在第一階段的質(zhì)量損失為10.61%，這一部分的質(zhì)量損失主要來(lái)自于結(jié)合水的散失[14]，這說(shuō)明凍干后的WVP-2可能比WVP-1具有更好的吸水和保水性。WVP-1和WVP-2的第二階段溫度范圍分別為160.38～346.78 ℃和121.08～342.88 ℃，其中WVP-1的熱分解溫度為290.50 ℃，WVP-2的熱分解溫度為308.50 ℃，對(duì)應(yīng)DTG曲線中的最小值且高于一般的熱殺菌溫度121 ℃，可見(jiàn)WVP-2在高溫下比WVP-1具有更好的熱加工穩(wěn)定性。以上結(jié)果說(shuō)明WVP-1和WVP-2具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.1.3 Zeta電位

用于開(kāi)發(fā)保健飲料的活性多糖通常需要其在水溶液中具有一定的穩(wěn)定性，避免分子絮凝而降低產(chǎn)品的品質(zhì)。Zeta電位是反映溶液體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，一般而言，Zeta電位的絕對(duì)值增加，分子間的靜電斥力增大，分子在體系中保持穩(wěn)定分散。如圖3所示，WVP-1的Zeta電位為9.60 mV，而WVP-2的Zeta電位為-18.50 mV，含有糖醛酸的酸性多糖的Zeta電位通常為負(fù)值[15]，這與WVP-2糖醛酸含量6.25%的結(jié)構(gòu)特征相一致。WVP-2的 Zeta電位的絕對(duì)值高于WVP-1，說(shuō)明WVP-2在水溶液中發(fā)生絮凝的趨勢(shì)弱于WVP-1，更加穩(wěn)定。此外，溶液中多糖分子的帶電情況會(huì)影響其形成多層納米薄膜的性能，帶電荷的多糖分子如皂莢種子中的半乳甘露聚糖易通過(guò)靜電過(guò)程形成薄膜，其 Zeta電位范圍為-13.70～-2.10 mV，WVP-2的Zeta電位絕對(duì)值更大，所帶電荷量更多，暗示其在一定程度上也可用于制備納米薄膜，進(jìn)而運(yùn)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。

2.1.4 特性粘度

高粘度的多糖可作為增稠劑或膠凝劑，用于調(diào)整食品的流動(dòng)性、可塑性和口感。圖4為多糖溶液濃度與比濃粘度的擬合曲線，由其與縱坐標(biāo)的截距可計(jì)算出WVP-1和WVP-2的特性粘度分別為5.33×10-3和3.80×10-2mL/mg。當(dāng)聚合物的溶劑、溫度一定時(shí)，特性粘度主要與聚合物的相對(duì)分子量有關(guān)[16]。WVP-2的特性粘度要遠(yuǎn)大于WVP-1，這可能與WVP-2的相對(duì)分子量Mw（56.97 ku）遠(yuǎn)大于WVP-1（3.16 ku）有關(guān)[3]。藍(lán)高爽[17]報(bào)道蒸玉竹和曬玉竹多糖的特性粘度分別為1.66×10-2和5.70×10-3mL/mg，并研制了玉竹山楂蘋(píng)果復(fù)合飲料和復(fù)合多糖類(lèi)保濕護(hù)膚劑，玉竹多糖與WVP-1和WVP-2的特性粘度較為接近，這說(shuō)明荸薺皮多糖可能也具有作為飲料和化妝品添加劑的前景。

2.1.5 酯化度

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì) WVP-2的結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)其為一種類(lèi)似果膠的多糖[3]。酯化度是果膠最基本的性質(zhì)，高酯果膠形成凝膠需要添加大量的蔗糖，而低酯果膠形成凝膠主要依賴于游離羧基和 Ca2+形成“蛋盒”模型。因此，低酯果膠的使用利于制作低糖分、低能量和低甜味的食品，更加符合現(xiàn)代人對(duì)健康的追求。由WVP-2紅外光譜（圖5）中1737.81 cm-1和1643.30 cm-1處的吸收峰面積，計(jì)算出 WVP-2的DE值為15.00%。DE＜50%的果膠屬于低酯果膠。因此，WVP-2可能具有類(lèi)似低酯果膠的性質(zhì)。目前我國(guó)具有豐富的高酯果膠資源，而低酯果膠的來(lái)源和含量較少。市面上低酯果膠的生產(chǎn)主要依賴于脫酯技術(shù)將來(lái)自于柑橘皮和蘋(píng)果皮中的高酯果膠轉(zhuǎn)化為低酯果膠[18]。已報(bào)道的低酯果膠的天然來(lái)源有薜荔籽（DE14.20%，糖醛酸含量 85.47%）、豆腐柴葉（DE14.90%，糖醛酸含量65.48%），其果膠均有較強(qiáng)的膠凝度[19]。因此，荸薺皮有可能作為一種新型的低酯果膠類(lèi)似物來(lái)源。

2.2 荸薺皮多糖抗氧化能力

2.2.1 細(xì)胞抗氧化能力

CAA法比直接清除化學(xué)類(lèi)自由基的模型更接近生物機(jī)體水平。熒光探針DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞酯酶分解為DCFH，AAPH誘發(fā)的過(guò)氧自由基攻擊細(xì)胞，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ROS水平升高，DCFH被氧化為熒光物 DCH。因此，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度越大，其中的ROS水平越高。從圖6可知，添加WVP-1和WVP-2后，AAPH誘發(fā)ROS水平隨時(shí)間推移而增加的速度有所減緩。濃度在500～1000 μg/mL時(shí)，WVP-1抑制細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 ROS的效果較好。在較低濃度條件下（125～250 μg/mL），WVP-2抑制細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的能力要強(qiáng)于WVP-1，說(shuō)明WVP-2可能比WVP-1具有更好的抗氧化活性。低分子量，高半乳糖、糖醛酸和β-構(gòu)型比例的多糖通常具有較好的抗氧化活性[20]，WVP-1的分子量較低但糖醛酸、半乳糖和β-構(gòu)型的比例低于WVP-2，這可能是導(dǎo)致二者抗氧化能力不同的原因。針對(duì)CAA模型中多糖的抗氧化機(jī)理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中WVP-1或WVP-2并未與AAPH直接發(fā)生相互作用，此外多糖樣品作為生物大分子，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效率低，因此抗氧化機(jī)理不太可能是多糖直接清除細(xì)胞內(nèi)外的自由基。多糖可能是通過(guò)與細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合后形成保護(hù)膜或是誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的抗氧化通路從而發(fā)揮抗氧化功能的。

2.2.2 抑制AAPH誘發(fā)的紅細(xì)胞氧化溶血

紅細(xì)胞細(xì)胞膜受到自由基的攻擊后發(fā)生脂質(zhì)氧化破裂，造成溶血現(xiàn)象。如圖7所示，在沒(méi)有抗氧化劑保護(hù)時(shí)，紅細(xì)胞遭受AAPH攻擊而破裂溶血的比率達(dá)到49.02%。無(wú)AAPH存在時(shí)，62.5～1000 μg/mL各濃度下WVP-1和WVP-2導(dǎo)致的溶血率與陰性對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異（p＞0.05），說(shuō)明該濃度范圍內(nèi)的WVP-1和WVP-2不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞膜破裂。與AAPH組相比，除1000 μg/mL的WVP-1外，62.5～1000 μg/mL濃度范圍內(nèi)的WVP-1和WVP-2均能顯著抑制AAPH誘發(fā)紅細(xì)胞氧化溶血，紅細(xì)胞破裂溶血的比率顯著降低（p＜0.05），并且二者均在500 μg/mL時(shí)抑制氧化溶血的效果最好，溶血率分別下降了4.39%和6.51%，WVP-2在62.5、250、500和1000 μg/mL時(shí)抑制氧化溶血的能力顯著強(qiáng)于WVP-1（p＜0.05）。與CAA模型不同的是，紅細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有DNA，不涉及抗氧化通路，在一定程度上說(shuō)明多糖在細(xì)胞水平中發(fā)揮抗氧化能力可能并不需要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)表達(dá)，而可能通過(guò)形成保護(hù)膜從而阻止存在于細(xì)胞外部的自由基通過(guò)氧化分解細(xì)胞膜導(dǎo)致的氧化損傷。

3 結(jié)論

荸薺皮純化多糖組分WVP-1和WVP-2具有較好的熱穩(wěn)定性和粘度特性等理化性質(zhì)，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域可能具有一定的應(yīng)用潛力。此外，WVP-1和WVP-2在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，并且WVP-2的抗氧化能力強(qiáng)于WVP-1，在營(yíng)養(yǎng)與健康領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。