芥菜疙瘩超微粉對小鼠慢性阻塞性肺炎的改善作用

陳嶺林，查學強，李強明，羅建平*，楊磊

（1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601）

（2.安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，安徽阜陽 236400）

芥菜疙瘩（Brassica napiformisL. H. Bariley）又名辣疙瘩、大頭芥、大頭菜，是十字花科蕓薹屬植物芥菜的一個變種，為我國常用的蔬菜之一。傳統(tǒng)中醫(yī)藥記載，芥菜具有宣肺豁痰、溫中利氣的功效?，F(xiàn)代研究表明，芥菜疙瘩中不僅具有普遍的生物活性成分（如膳食纖維、多糖、維生素、多酚和黃酮等），而且還具有十字花科植物特有的硫苷和其代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯等生物活性成分，具有抗炎[1]和抗氧化[2]的生物活性。芥菜疙瘩在全國各省均有種植，其栽培面積超過1.0×106hm2，產(chǎn)量約 4.5×107t[3]。目前芥菜疙瘩的加工仍以傳統(tǒng)腌制小菜為主，加工手段初級、產(chǎn)品類型單一、附加值低、市場競爭力弱，迫切需要改變傳統(tǒng)的加工模式，尋找新的加工利用途徑，從而改變產(chǎn)業(yè)發(fā)展困滯于產(chǎn)業(yè)鏈低端的局面。

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的伴有氣流阻塞的慢性疾病，是世界上第四大致死疾病[4]。在中國，呼吸系統(tǒng)疾病死亡人數(shù)（主要是慢性阻塞性肺疾?。┰谥饕膊〉乃劳鋈藬?shù)中排名第四[5]，且農(nóng)村死亡率明顯高于城市。果蔬超微粉對果蔬的有效成分具有更高的溶出率，其生物活性功能優(yōu)于普通粉[6-9]，采用超微粉碎技術(shù)對芥菜疙瘩凍干樣品進行粉碎，能基本完整保留芥菜疙瘩的功效成分。本研究基于果蔬超微粉的優(yōu)良特性[10]，以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）鼻腔滴注構(gòu)建 COPD小鼠模型，并以芥菜疙瘩普通粉（Brassica napiformisordinary powder，BOP）為對照，從抗炎和抗氧化的角度研究芥菜疙瘩超微粉（Brassica napiformisultrafine powder，BUP）對COPD小鼠肺炎的影響，旨在為芥菜疙瘩超微粉的高值化加工利用提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料與動物

芥菜疙瘩由安徽省臨泉縣安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供；BUP（粒徑18.311±0.008 μm）由芥菜疙瘩切塊凍干后經(jīng)中藥超微粉碎機以進樣體積0.6 L、粉碎時間20 min制得；BOP（粒徑86.025±0.293 μm）由高速破碎機破碎芥菜疙瘩凍干樣品并過 60目孔篩制得。SPF級 C57BL/6J小鼠（合格證編號：NO.202011402），購買于常州市卡文斯實驗動物有限公司（許可證號：SCSK(蘇)2016-0010）。小鼠飼養(yǎng)在標準 SPF級動物房（溫度：23±2 ℃，相對濕度：50%～60%，光照12 h/d），自由攝食攝水，適應性喂養(yǎng)1 w。

1.1.2 主要實驗試劑

異硫氰酸烯丙酯、蘿卜硫苷，Sigma Inc.；蘆丁、沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松（Dexamethasone，Dex），白鯊生物科技有限公司；一氧化氮（Nitric oxide，NO）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、ECL化學發(fā)光、RNA抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxidase，SOD）試劑盒，南京建成科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 Elisa試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix、iScript cDNA Synthesis試劑盒，Bio-Rad Laboratories, Inc.；CD11b、MHCII、F4/80、CD11c、FoxP3、CD25 抗體，BD Biosciences；CD68、Ly6G 抗體，賽維爾生物科技有限公司；p65、IκB、p-IκB、NF-κB、Nrf2 抗體，Proteintech，Group, Inc.；Phospho-NF-κB p65 抗體，Abclonal Biotech Co. Ltd.。

1.2 主要儀器與設備

TU-1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SC21CL冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；XDW-6J超微粉碎機，濟南達微機械有限公司；Sl-150高速多功能粉碎機，江蘇永康市松青五金廠；WIX-EP600電泳儀，韋克斯科技(北京)有限公司；Varioskan Flash全波長酶標儀，Thermo Fisher公司；Image Quant LAS 4000 mini熒光成像系統(tǒng)，GE Healthcare公司；MoFlo XDP流式細胞儀，Beckman Coulter公司；P250 FLASH病理切片掃描顯微鏡，3D HISTECH公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 芥菜疙瘩粉體活性成分的測定

取適量BUP和BOP，按照GB 5009.88-2014測定其膳食纖維的含量，按照唐明明等[11]的方法測定多酚和黃酮的含量，按照Doorn等[12]的方法測定硫苷的含量，按照方海仙等[13]的方法異硫氰酸酯的溶出率；每組樣本獨立檢測3次。

1.3.2 小鼠實驗分組造模、給藥及一般情況觀察

小鼠隨機分成 7組（n=8），分別為正常組（Control）、模型組（LPS）、陽性藥組（LPS+Dex）、超微粉高劑量組（LPS+6% BUP）、超微粉低劑量組（LPS+2% BUP）、普通粉高劑量組（LPS+6% BOP）和普通粉低劑量組（LPS+2% BOP）。造模參照Janbazacyabar等[14]的方法，第 28 d造模結(jié)束后，LPS+Dex 按照 1 mg/(kg·d)地塞米松劑量給藥[15]，芥菜疙瘩粉體飼料高、低劑量[16]分別是100 g飼料中含有對應粉體含量的6 g和2 g，其余組都給予正常飼料，連續(xù)30 d。整個周期結(jié)束后，對小鼠進行隔夜禁食處理。實驗期間對小鼠一般情況觀察并記錄體重變化。

1.3.3 小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的流式細胞計數(shù)分析

CO2處死小鼠，收集小鼠BALF[17]，將收集的細胞混勻后分成5個組別，即調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）組、樹突狀細胞（DC）組、肺泡巨噬細胞（AM）組、中性粒細胞（NE）組以及活性氧（ROS）組，分別加入各細胞對應的熒光抗體，即 Treg為 CD25-FITC和Foxp3-APC、DC為CD11c-APC和MHCII-PE、AM為CD11c-APC和F4/80-FITC、NE為CD11b-FITC和Ly6G-PE，室溫（25 ℃）環(huán)境下孵育30 min后以流式細胞儀檢測幾種細胞的比例；BALF中ROS含量變化按照試劑盒說明書測定[18,19]。每組樣品重復上述實驗平行三次，實驗結(jié)果采用flowjo（V 10.5.3，BD Life Sciences，USA）進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 肺組織病理學染色和免疫組化分析

CO2處死小鼠，收集小鼠肺組織，計算肺系數(shù)（肺組織重量與該小鼠對應體重的比值）；肺組織以 4%多聚甲醛固定后分別按Li等[20]、Fleur等[21]和Wang等[22]的方法制備H&E染色、Masson染色、CD68和Ly6G免疫組化切片，并在顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 小鼠肺組織中細胞因子和氧化應激相關因子的測定

取適量肺組織，分別以IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒對小鼠肺組織中細胞因子的含量進行測定；分別以超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、一氧化氮和丙二醛檢測試劑盒測定小鼠肺組織中氧化應激相關因子的含量。

1.3.6 肺組織RT-PCR分析

取適量肺組織，按照RNA提取試劑盒提出RNA，以 iScript cDNA Synthesis試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，參照iTaq Universal SYBR Green Supermix試劑盒進行血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1）的熒光定量PCR實驗，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算其相對mRNA的水平（以GAPDH為內(nèi)參）。引物購買于生工生物工程股份有限公司，序列為：GADPH正向：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；HO-1正向：5′-CTGACCCATGACACCAAGGAC-3′，反向：5′-AAA GCCCTACAGCAACTGTCG-3′；NQO1 正向：5′-GGC AGAAGAGCACTGATCGTA-3′，反向：5′-TGATGGG ATTGAAGTTCATGGC-3′。

1.3.7 肺組織Western blot實驗

取適量肺組織，對肺組織內(nèi)的全蛋白進行提取，對所提蛋白進行Western blot實驗[23]，分別分析肺組織內(nèi) p65、p-p65、IκB、p-IκB、Nrf2 等蛋白的表達水平。用Image Quant LAS 4000 mini熒光成像系統(tǒng)進行成像并拍照保存，拍照結(jié)果用Image J軟件（以β-actin作為內(nèi)參）進行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以Mean±SD表示，運用One-Way ANOVA檢驗方法分析各組之間的顯著性差異，不同字母表示組與組之間具有顯著性差異（p＜0.05），根據(jù)統(tǒng)計的結(jié)果，用Orign 9.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 BUP的活性成分溶出率

表1 芥菜疙瘩普通粉（BOP）和超微粉(BUP)活性成分溶出率比較Table 1 Comparison of the dissolution rate of active ingredients in BOP and BUP

BUP的粒徑只有BOP的21%，兩種粉體的活性成分溶出率測定（表1）表明，BUP中可溶性膳食纖維、多酚、黃酮以及其特有的硫苷和異硫氰酸酯的溶出率均高于BOP，表明超微粉碎可使芥菜疙瘩中的活性成分更加容易釋放出來。

2.2 BUP對COPD小鼠一般情況及肺組織病理學的影響

小鼠經(jīng)過LPS造模以后，與正常組相比，其體重增長速度開始減緩，精神狀態(tài)欠佳。造模結(jié)束后開始給藥，與模型組相比，陽性組小鼠和芥菜疙瘩粉體組小鼠體重增長速度開始恢復，精神狀態(tài)開始恢復；并且BUP組小鼠的體重恢復速度比BOP組小鼠更快。解剖小鼠后對小鼠肺組織進行肺系數(shù)計算可知，與正常組相比，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增大；與模型組相比，陽性藥和芥菜疙瘩粉體組小鼠的小鼠肺系數(shù)降低。如圖1所示，LPS造模會導致COPD小鼠肺組織發(fā)生炎性細胞浸潤，肺泡壁和支氣管增粗（圖1a）、肺組織纖維化（圖1b），同時也會導致小鼠肺組織支氣管發(fā)生巨噬細胞浸潤（圖1c）和肺泡壁中性粒細胞浸潤（圖1d）。通過給小鼠日糧飼料添加BUP可以緩解小鼠的COPD癥狀，雖然其作用效果與陽性藥地塞米松相比略有不足，但對肺組織的改善效果優(yōu)于BOP。

2.3 BUP對COPD小鼠肺泡灌洗液免疫細胞比例的影響

小鼠BALF中炎性相關細胞Treg、AM、DC和NE的流式細胞分析表明，與正常組小鼠BALF中Treg細胞比例（6.88%）相比，LPS造模導致小鼠 BALF中的Treg細胞比例變少（3.02%），陽性藥地塞米松明顯改善其比例（6.45%），芥菜疙瘩粉也能提升Treg的比例，其中BUP的效果最優(yōu)（5.89%）（圖2a）。同時，與正常組的AM（3.43%）、DC（19.87%）和NE（1.62%）的細胞比例相比，模型組小鼠BALF中的AM、DC和NE均顯著提高，分別升高了3.56、0.39和7.02倍，而給藥地塞米松和芥菜疙瘩粉體均能降低COPD小鼠BALF中AM、DC和NE細胞的比例，且BUP降低的比例優(yōu)于 BOP（圖 2b、2c、2d）。研究結(jié)果表明芥菜疙瘩能調(diào)節(jié)小鼠BALF中的細胞比例，進而改善LPS引起的COPD。

2.4 BUP對COPD小鼠肺組織炎癥相關因子的影響

LPS造成炎性細胞大量聚集，釋放大量的炎性細胞因子參與肺的炎癥損傷過程[24]。通過圖 3a、3b分析得知，與正常組的促炎因子 IL-1β（226.95±4.48 pg/mg prot）和IL-6（134.97 pg/mg prot）的水平相比，通過LPS誘導小鼠COPD以后，肺組織中IL-1β和IL-6的水平分別增高到329.74 pg/mg prot和199.55 pg/mg prot，通過給藥陽性藥和芥菜疙瘩粉體具有抑制IL-1β和IL-6增多的趨勢；同理，如圖3c所示，與正常組抗炎因子 IL-10的水平（219.48 pg/mg prot）相比，COPD模型小鼠肺組織中其水平明顯降低（165.48 pg/mg prot），通過給予陽性藥和芥菜疙瘩粉體均能增高IL-10的水平，從而改善COPD小鼠的炎癥水平。

2.5 BUP對COPD小鼠肺組織炎性信號通路的影響

NF-κB信號通路是目前已知最主要的調(diào)節(jié)炎癥的通路之一，主要參與調(diào)控機體內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生和細胞的存活，在調(diào)節(jié)致病菌感染的免疫應答中起關鍵作用[25]。如圖4所示，通過對小鼠肺臟的炎性通路蛋白進行western bloting分析，結(jié)果表明，與對照組相比，LPS誘導小鼠肺臟NF-κB通路的激活，其肺組織內(nèi)的p-p65（p-NF-κB）和 p-IκB 的表達增加，表明 NF-κB-p65可能向核內(nèi)轉(zhuǎn)移促進炎癥因子的表達，從而誘導炎癥的發(fā)生；而BUP能抑制COPD小鼠肺組織內(nèi)p65和IκB的磷酸化，從而改善COPD小鼠的炎癥，同時可以看出BUP在改善COPD小鼠炎性信號通路的效果優(yōu)于BOP。

2.6 BUP對COPD小鼠氧化應激相關因子和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

越來越多的證據(jù)證明，活化的細胞體內(nèi)耗氧量會增加，從而導致ROS的過量產(chǎn)生，因此維持機體ROS的穩(wěn)態(tài)至關重要[26]。從圖5可以看出，正常小鼠經(jīng)LPS誘導COPD后，其肺泡灌洗液活性氧平衡被破壞（5a），肺組織內(nèi)NO含量增加（5b，由15.14 pg/mg prot增加至27.41 pg/mg prot），CAT（5c），GSH-Px（5d）和SOD（5e）表達下降（分別由3.62 U/mg prot、251.43 μmol/mg prot、91.00 U/mg prot下降至 1.88 U/mg prot、90.36 μmol/mg prot、10.72 U/mg prot），促使氧自由基過量產(chǎn)生對機體有傷害的物質(zhì)MDA（5f，含量增加了152.71%），表明LPS破壞了COPD小鼠細胞膜，致使肺組織發(fā)生損傷。通過給予地塞米松和芥菜疙瘩粉體后能夠降低COPD小鼠體內(nèi)的NO和MDA，升高CAT、GSH-Px和SOD的水平，進而平衡氧化應激過程。

2.7 BUP對COPD小鼠抗氧化通路的影響

如圖6所示，LPS造模會導致COPD小鼠肺組織內(nèi)的HO-1 mRNA（6a）、NQO-1 mRNA（6b）表達下降，說明機體內(nèi)的解毒酶表達不足。Nrf2被認為是一種調(diào)節(jié)抗氧化能力的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2信號通路的激活是細胞防御氧化應激的主要機制[27]。通過對小鼠飼喂芥菜疙瘩粉體，能夠增加Nrf2蛋白水平的表達（6c、6d），Nrf2被轉(zhuǎn)運到細胞核從而可能上調(diào)大量抗氧化酶（CAT、GSH-Px和SOD等）和異種生物解毒基因（HO-1 mRNA和NQO-1 mRNA等）的表達，進而改善小鼠的COPD。

3 結(jié)論

本研究以芥菜疙瘩制備BUP，并與BOP對比，研究BUP活性成分浸出率的變化和其對COPD小鼠的改善作用及機制。相較于BOP，BUP具有更高的活性成分浸出率，且BUP能夠通過抗炎和抗氧化通路調(diào)節(jié)COPD小鼠的免疫細胞比例、細胞因子和氧化應激相關因子的釋放，改善COPD小鼠的肺氣腫和肺纖維化，從而改善COPD小鼠的肺炎，且其效果優(yōu)于BOP。綜上可知，BUP活性成分溶出率高且能夠改善 LPS誘導的COPD小鼠，該結(jié)果為芥菜疙瘩的精深加工利用和功能食品的開發(fā)研究提供了新的理論依據(jù)。