CXCL家族作為肝癌微環(huán)境預后與治療標志物的生物信息學分析

馬莉， 楊文娟， 馬青梅， 馬夢婷， 張嬌弟， 張倩， 劉欣躍，2*

(1.蘭州大學 第二醫(yī)院 藥物基因組學重點實驗室, 甘肅 蘭州 730030; 2.蘭州大學 第二醫(yī)院 檢驗醫(yī)學中心, 甘肅 蘭州 730030)

肝癌是最常見的致死性消化道惡性腫瘤之一，在全球癌癥數(shù)據(jù)中，原發(fā)性肝癌發(fā)病率排第7、致死率排第2[1]。肝癌的分型中，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最主要的類型，約占75%[2]。雖然手術切除、介入、消融、靶向治療等方法已取得一定進展，但由于肝癌細胞對常規(guī)放化療不敏感，多數(shù)肝癌患者的預后仍較差。近年來，通過調(diào)節(jié)機體免疫功能、改變腫瘤微環(huán)境來干預腫瘤進展的免疫療法已成為一種極具潛力的臨床治療方案[3]，但仍缺乏針對肝癌有效的治療與預后標志物。

趨化因子由具有趨化功能的細胞因子家族構成，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關。CXCL[chemokine (C-X-C motif) ligand]家族是趨化因子的重要組成部分，主要引起細胞的定向遷移，在炎癥中可誘導免疫細胞遷移，如T細胞、B細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞等[4]，而長期炎癥刺激是導致促腫瘤發(fā)生發(fā)展微環(huán)境形成的因素之一。研究表明，CXCL家族可通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境促進腫瘤逃避免疫監(jiān)視，影響腫瘤進展[5]。HCC細胞通過提高CXCL1的分泌，減少腫瘤細胞凋亡來促進肝癌進程，而靶向沉默CXCL1可抑制腫瘤生長[6]。CXCL4具有抗炎作用，促進其表達可緩解肝臟損傷[7]。CXCL9通過破壞細胞屏障及骨架，減少細胞黏附，進而促進腫瘤細胞生長[8-9]。CXCL2、CXCL6、CXCL11、CXCL13在HCC組織中高表達，與肝癌患者的轉移和預后密切相關[10]。 CXCL14是常見的腫瘤抑制因子，在肝癌組織中表達常常受到抑制[11]。CXCL3、CXCL5、CXCL8高表達與肝癌臨床分期和腫瘤浸潤密切相關[12-15]。CXCL17通過LKB1-AMPK途徑促進HCC中的腫瘤細胞轉移并抑制自噬[16]。CXCL7、CXCL12、CXCL13、CXCL16則與惡性腫瘤的肝轉移相關[17]。干預CXCL9、CXCL10，可刺激T細胞進入腫瘤微環(huán)境，實現(xiàn)對肝癌的免疫治療[15-18]。此外，研究表明CXCL家族中的成員可能參與上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移具有相關性[19]。因此，探討CXCL家族在作為肝癌的治療與預后標志物方面的作用，具有重要意義。

現(xiàn)有的研究僅證實了部分CXCL趨化因子的生物學功能，本研究擬通過生物信息學分析，全面預測肝癌中具有差異表達的CXCL趨化因子，并評估CXCL趨化因子與肝癌患者EMT、免疫浸潤的相關性，以探討其作為肝癌臨床治療與預后標志物的價值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫選擇

1.1.1 UNIPROT

UNIPROT(https://www.uniprot.org/)是一種包含大量蛋白質(zhì)信息，包括結構、序列和分類等的數(shù)據(jù)庫[20]。使用UNIPROT數(shù)據(jù)庫檢索CXCL家族的全部組成成員。

1.1.2 ONCOMINE

ONCOMINE(https://www.oncomine.org/)是由多種癌基因芯片組成的、能夠進行全基因組表達分析的數(shù)據(jù)庫[21]。使用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫評估不同CXCL趨化因子在肝癌患者中的表達量。在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中依次檢索、對比HCC患者肝癌和正常肝臟組織中CXCL趨化因子轉錄水平的表達差異，數(shù)據(jù)類型選擇為mRNA，以P<0.01且 Fold Change為2，篩選出排名前10%的基因數(shù)據(jù)集依次提取篩選的數(shù)據(jù)并繪制成圖。

1.1.3 TCGA

TCGA(the cancer genome atlas homepage)是一項包含多種人類腫瘤致癌基因組改變的公共數(shù)據(jù)庫(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga)[22]。為確定CXCL趨化因子在肝癌中的表達量，使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CXCL家族在肝癌與正常肝臟組織中的表達量。

1.1.4 STRING

STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫[23]是一種通過計算蛋白潛在功能來預測蛋白間相互作用的在線分析網(wǎng)站。使用STRING數(shù)據(jù)庫分析CXCL家族與EMT標志蛋白的相互作用，從而預測其在肝癌EMT中的作用。

1.1.5 TIMER

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫[24]是一種評判免疫細胞浸潤及其對疾病影響的分析網(wǎng)站。使用TIMER數(shù)據(jù)庫預測并評估差異表達的CXCL趨化因子與肝癌患者免疫細胞浸潤之間的相關性。

1.2 數(shù)據(jù)分析

在數(shù)據(jù)庫進行在線數(shù)據(jù)分析，或?qū)С鰯?shù)據(jù)后再對數(shù)據(jù)進行二次分析。癌組織中目的基因表達量高于正常肝臟組織計為高表達組，反之為低表達組。在Kaplan-Meier Plotter(KMPLOT)網(wǎng)站 (http://kmplot.com/)[25]分析差異表達的CXCL趨化因子與HCC患者不良預后的相關性，并繪制生存曲線。使用R語言繪制CXCL家族的表達熱圖，并使用ESIMATE算法計算CXCL家族在肝癌腫瘤基質(zhì)微環(huán)境中immune score與 estimate score，得出其與腫瘤純度的相關性。使用R語言中的Xcell算法計算CXCL家族與免疫抑制因子及免疫抑制招募因子等的相關性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用獨立樣本t檢驗分析CXCL因子在肝癌與正常組織中的表達差異；使用Kaplan-Meier分析不同CXCL因子與肝癌患者預后的關系[26]；其余統(tǒng)計學分析均在相關數(shù)據(jù)庫在線完成。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者CXCL趨化因子的表達情況

UNIPROT數(shù)據(jù)庫中共檢索出16種CXCL趨化因子，分別為CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16和CXCL17。基于ONCOMINE數(shù)據(jù)庫的結果顯示，與正常肝臟組織相比，肝癌組織中CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11高表達(P<0.05)，CXCL2、CXCL7、CXCL12和CXCL14低表達(P<0.05)(圖1)?；赥CGA數(shù)據(jù)庫繪制的熱圖結果顯示，所有CXCL趨化因子中，CXCL6、CXCL8、CXCL9和CXCL10在肝癌組織中相對高表達(P<0.05)，而CXCL2、CXCL12和CXCL14在肝癌中的表達量則相對低于正常肝臟組織(P<0.05)(圖2)。

2.2 CXCL趨化因子在HCC患者中的預后價值

將腫瘤組織與正常組織中表達量相近的CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL13排除，選擇CXCL2、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL16、CXCL17繼續(xù)進行下一步研究。KMPLOT數(shù)據(jù)庫的生存曲線顯示高轉錄水平的CXCL2、CXCL4、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL12，以及低轉錄水平CXCL6與肝癌患者更長的生存期顯著相關(P<0.05)(圖3)。

2.3 CXCL趨化因子與HCC細胞EMT密切相關

STRING數(shù)據(jù)庫顯示CXCL家族與EMT相關標志基因，包括緊密連接蛋白1(tight junction protein 1，TJP1)、CDC20樣蛋白1(CDC20-like protein 1,CDH1)、鈣粘蛋白 2(cadherin-2，CDH2)、纖連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)、波形蛋白(vimentin，VIM)、連環(huán)蛋白β-1(catenin beta-1，CTNNB1)、扭曲相關蛋白1(twist-related protein 1，TWIST1)、鋅指轉錄因子 2(snail family transcriptional repressor 2，SNAI2)、鋅指轉錄因子 1(snail family transcriptional repressor 1，SNAI1)和α肌動蛋白 2(alpha-actin-2，ACTA2)等，具有相互作用關系(圖4A)。CXCL家族與EMT標志蛋白相關性見熱圖(圖4B)。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示CXCL8與CDH1、CDH2、SNAI1、TJP1、FN1密切相關(P<0.05)(圖4C)。

CXCL1、CXCL16、CXCL17數(shù)據(jù)提取自Wurmbach liver[27]，CXCL2提取自Chen liver[28]，CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL11、CXCL13數(shù)據(jù)提取自Mas liver[29]，CXCL5、CXCL10、CXCL12、CXCL14數(shù)據(jù)提取自Roessler liver[30]

圖2 CXCL基因在肝癌中的熱圖分析

圖3 不同CXCL趨化因子在HCC患者中的預后價值

A: CXCL家族與EMT標志蛋白的PPI分析圖，黃色代表上調(diào)基因，藍色代表下調(diào)基因，綠色代表無差異表達基因，紅色代表EMT標志蛋白，連線表示基因間相互作用; B: CXCL家族與EMT的相關性熱圖; C: CXCL8與EMT標志蛋白的相關性分析

2.4 CXCL趨化因子與HCC患者免疫細胞浸潤的相關性

CXCL家族與HCC純度的相關性見熱圖(圖5)。Xcell算法顯示CXCL家族與免疫抑制因子及免疫抑制招募因子存在明顯相關性(圖6)。TIMER數(shù)據(jù)庫結果顯示差異表達的CXCL趨化因子與肝癌患者免疫細胞浸潤呈正相關(圖7)。其中CXCL2與中性粒細胞浸潤呈正相關(P<0.05)；CXCL4(PF4)與巨噬細胞和中性粒細胞浸潤呈正相關(P<0.05)；CXCL7(PPBP)僅與中性粒細胞的浸潤呈正相關(P<0.05)。CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14和CXCL16與所有炎癥細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞)浸潤均密切相關(P<0.05)；而CXCL17僅與B細胞和CD4+T細胞浸潤呈正相關(P<0.05)。

圖5 CXCL家族與肝癌腫瘤純度的相關性

圖6 CXCL家族與肝癌免疫因子的相關性

(續(xù)上圖)

A: CXCL2與免疫細胞浸潤的關系;B: CXCL4與免疫細胞浸潤的關系; C: CXCL6與免疫細胞浸潤的關系; D: CXCL7與免疫細胞浸潤的關系; E: CXCL9與免疫細胞浸潤的關系; F: CXCL10與免疫細胞浸潤的關系; G: CXCL11與免疫細胞浸潤的關系; H: CXCL12與免疫細胞浸潤的關系; I: CXCL14與免疫細胞浸潤的關系; J: CXCL16與免疫細胞浸潤的關系; K: CXCL17與免疫細胞浸潤的關系

3 討論

肝癌是惡性程度最高的消化道腫瘤之一，目前外科手術切除仍然是治療肝癌最有效的方法。但由于缺乏有效的早期診斷且病情進展迅速，多數(shù)患者在確診時已錯過手術最佳時間。研究表明腫瘤與腫瘤微環(huán)境間的相互作用在肝癌的進展中具有重要作用，趨化因子通過與對應的受體結合，調(diào)節(jié)微環(huán)境中細胞遷移和信號傳導[31]。作為趨化因子的重要組成部分，CXCL家族可在炎癥中誘發(fā)免疫細胞遷移，參與炎性促腫瘤微環(huán)境形成[32]。然而，目前對CXCL家族在肝癌中作用的研究報道較少，在肝癌生物學功能和預后方面尚無相關的生物信息學驗證。本研究通過生物信息學分析表明CXCL趨化因子在肝癌的臨床治療、預后中具有潛在的標志作用。

UNIPROT數(shù)據(jù)庫包含了癌癥研究中的大多數(shù)基因類型。本研究使用UNIPROT數(shù)據(jù)庫檢索了CXCL家族的全部成員，并使用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫評估了不同CXCL趨化因子在肝癌患者中的表達量，結果顯示HCC患者肝癌組織和正常肝臟組織中CXCL趨化因子在轉錄水平具有顯著的表達差異，其中CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10在肝癌組織中顯著高表達，CXCL2、CXCL12、CXCL14在肝癌中顯著低表達。CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL14在既往的肝癌研究中已有報道[33-35]，但其與肝癌的臨床預后是否相關仍缺乏研究支持。KMPLOT網(wǎng)站分析結果表明，CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL12高表達和CXCL6低表達的肝癌患者具有更長的生存期，因此推測其可作為判斷肝癌患者預后的標志物。

EMT是上皮細胞失去極性和連接作用而轉為間充質(zhì)表型、誘發(fā)遷移和侵襲能力增強的過程[36-37]，是上皮細胞轉為惡性表型的重要機制[38]。本課題組推測CXCL家族可能參與肝癌的EMT。本研究使用STRING、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了肝癌患者CXCL家族與EMT相關標志基因間的相互作用及相關性程度，結果表明CXCL8是與EMT標志基因相關性最高的趨化因子，與肝癌細胞的遷移、侵襲等細胞生物學行為密切相關。CXCL8(IL8)是由上皮細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和氣道平滑肌細胞產(chǎn)生的細胞因子，在肝癌組織中一般高表達，其參與肝癌EMT已有研究報道，但具體機制仍未闡明。Yu等[39]的研究顯示，肝細胞癌中過度激活的神經(jīng)降壓素(NTS)/IL-8通路與癌細胞EMT增強、腫瘤微環(huán)境炎癥增多及不良預后相關。Peng等[40]證實，IL8/ERK1/2/SNAI1 和 IL-8/STAT3/TWIST1 兩種不同的信號通路參與了CXCL8誘導肝癌細胞EMT并促進其遷移和侵襲的過程。同時也有研究顯示，CXCL8對多種腫瘤細胞EMT發(fā)生均具有直接或間接的促進作用，如胃癌[41]、結直腸癌[42]、乳腺癌[43]、宮頸癌[44]、卵巢癌[37]等。上述研究均從機制方面證實了本研究的發(fā)現(xiàn)，即CXCL8參與肝癌細胞的遷移和侵襲，可將其作為判斷肝癌EMT的生物標志物。

免疫細胞浸潤是促進腫瘤發(fā)展的重要因素，干預腫瘤微環(huán)境中免疫細胞水平的免疫治療也成了近年的研究熱點[45]。趨化因子與免疫細胞的遷移和定位相關，是誘發(fā)炎癥反應的重要介質(zhì)[46]，腫瘤微環(huán)境中趨化因子與免疫細胞的聯(lián)合干預，是近年腫瘤免疫治療的新方式。針對B細胞與T細胞介導的機體免疫，如PD1、PDL1和CAR-T等，是當前腫瘤免疫治療的主要靶點[47-48]。已有研究證實，聯(lián)合抑制CXCL12和PD1對晚期轉移性結直腸癌和胰腺癌有較明顯的治療效果，且安全性良好[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL趨化因子與免疫細胞浸潤存在顯著相關性，尤其是B細胞與T細胞，其中CXCL9、CXCL10、CXCL11與免疫細胞浸潤相關性最為顯著。研究表明，CXCL9在肝癌患者以PD1/PDL1為基礎的免疫檢查點抑制劑治療中具有預測療效的作用[34]。Yan等[50]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1，IRF-1)通過調(diào)節(jié)CXCL10/CXCR3軸誘發(fā)HCC細胞的抗腫瘤免疫效應。CXCL11可能通過自分泌方式激活 ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)肝癌細胞的自我更新和致瘤性[51]。上述報道均佐證了本研究的發(fā)現(xiàn)，即CXCL家族不僅可作為HCC不良預后指標，同時可作為評判腫瘤免疫浸潤的重要因素，其中CXCL9、CXCL10、CXCL11是最具有潛力的免疫浸潤標志物，可用于輔助評估肝癌的臨床治療效果。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析證實CXCL趨化因子與肝癌的進展及預后密切相關，同時也可以反映機體免疫狀態(tài)。其中，高表達CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL12和低表達CXCL6與良好的預后有關。CXCL8可作為評估肝癌患者EMT進展的生物標志物。CXCL9、CXCL10和CXCL11與多種免疫細胞浸潤均相關，可作為評價肝癌免疫治療效果的標志物。

本研究有一定的局限性。首先，檢索的數(shù)據(jù)庫有限，不能涵蓋肝癌相關的所有趨化因子，因此研究結果的代表性有局限。其次，生物信息學研究僅探討基因轉錄水平的變化，尚不能反映機體的整體狀態(tài)，后續(xù)還需進行體內(nèi)與體外實驗證實本研究的預測結果。

作者貢獻聲明

馬莉: 研究設計，數(shù)據(jù)檢索，數(shù)據(jù)分析，論文撰寫;楊文娟：數(shù)據(jù)檢索，數(shù)據(jù)分析；馬青梅：數(shù)據(jù)檢索，熱圖分析；馬夢婷：數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計分析；張嬌弟：統(tǒng)計分析，圖片繪制；張倩：數(shù)據(jù)分析；劉欣躍：研究設計，論文審校。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。