早孕小鼠子宮內(nèi)膜組織中IASPP表達對胚胎著床的作用

李娜， 苗聰秀， 李莉娜， 馬甜思， 苗卉

(1.長治醫(yī)學院 附屬和平醫(yī)院 生殖遺傳科∥長治醫(yī)學院 生殖遺傳研究所∥山西省衛(wèi)健委生殖工程委級重點實驗室, 山西 長治 046000； 2.長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院 病理科， 山西 長治 046000)

胚胎著床是決定人類及哺乳動物是否妊娠成功的一個重要環(huán)節(jié)，但目前對胚胎著床的機制尚未清楚明確。胚胎著床主要受滋養(yǎng)層細胞的介導，其中在“著床窗”開放期，具有侵入性胚泡和處于容受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜同步發(fā)育是決定胚泡是否成功植入的關(guān)鍵，而此過程則受極其復雜、精細的多因素調(diào)節(jié)，因此也是研究的關(guān)鍵所在[1]。部分學者將胚胎視為“良性瘤”，這是因為腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移與胚胎著床時胚胎滋養(yǎng)層侵入子宮內(nèi)膜的過程等生物學行為極為相似，并且胚胎著床的過程中也有不少在腫瘤生長中發(fā)揮作用的原癌基因和抑癌基因參與其中[2]。P53凋亡刺激蛋白抑制因子(inhibitory member of the ASPP family，IASPP)作為腫瘤基因家族的其中一員，它與目前臨床公認較為重要的腫瘤抑制基因p53相互作用后有遏制P53誘導的細胞凋亡能力[3]。鑒于目前有關(guān)子宮內(nèi)膜組織中IASPP的表達對胚胎著床作用的研究較少，因此本研究小組建立小鼠模型來展開其相關(guān)性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級NIH小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證編號：SCXK(京)2019-0011]。本實驗選取6～8周齡清潔級NIH小鼠105只，體質(zhì)量分布在20～25 g，其中雌性小鼠70只，雄性小鼠35只，實驗過程中對動物的處置流程嚴格遵循我國科技部于2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》(國科發(fā)財字[2006]398號)。

1.2 儀器和試劑

本實驗使用的儀器和試劑如下：Santa Cruz Biotechnology公司生產(chǎn)的兔抗人IASPP單克隆抗體及鼠抗人β-Actin單克隆抗體、Thermo Scientific的PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒、北京中山生物公司生產(chǎn)的三步法免疫組織化學試劑盒、全式金公司的Top Green qPCR SuperMix試劑盒、日本OLYMPUS生產(chǎn)的HAIPS-1000高清晰彩色病理圖像測量系統(tǒng)及原平皓生物公司的化學發(fā)光儀。

1.3 實驗過程

1.3.1 子宮組織的收集

小鼠飼養(yǎng)于室溫37 ℃的環(huán)境中，設置14 h光照，10 h黑暗的條件。將雌性小鼠和雄性小鼠按2∶1合籠交配(其中雌性小鼠70只，雄性小鼠35只)，次日早上7點檢查雌性小鼠的陰道來判斷發(fā)情周期，未受孕的雌性小鼠記為Day 0(共8只未受孕)，其余62只雌性小鼠陰栓均呈陽性，即診斷為妊娠，記為受孕第1天(Day 1)。

分別于妊娠Day0(未孕鼠)、2、3、4、5、6、7取出實驗鼠，其中Day0 6只，Day2、3、5、6、7孕鼠各6只，Day4孕鼠取26只，對孕鼠進行脫頸脫臼方法處死，解剖孕鼠取子宮組織，去除子宮周圍的結(jié)締組織，生理鹽水沖干凈并用濾紙擦干臟器表面的血污，分裝凍存于液氮備用，其余放入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛中固定和保存，脫水后石蠟包埋并切片備用。

1.3.2 熒光定量PCR

將預提取RNA的子宮組織在液氮中快速冷凍2 h以上，后于-80 ℃中放置24 h，提取前在冰上解凍，取合適大小的組織塊于2 mL離心管中，加入800 μL配制好的1×RIPA蛋白裂解液，放入1顆磁珠，于高通量組織破碎儀上將組織研磨成勻漿，50 Hz，10 s/次，7～8次，注意配平。隨后通過Trizol法提取雌鼠子宮組織的總RNA，加入體積分數(shù)為0.01%的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)溶液達到RNA溶解的目的，通過BioTek多孔酶標儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR實驗對cDNA進行半定量分析。引物序列：IASPP引物，上游5’-GACGTTAAACGCACTAAGCAT-3’，下游5’-GG-CTACGACCCCGTATAG-3’；β-actin引物，上游5’-TCTAATGACGTCTCGCTGCT-3’，下游5’-GTAGA-CGACGTACGTCGTCT-3’。PCR程序設置：預變性階段，95 ℃ 5 min；變性階段，94 ℃ 30 s；退火階段，60 ℃ 30 s；延伸階段，72 ℃ 45 s，循環(huán)29次；再次延伸，72 ℃ 10 min。

1.3.3 IASPP蛋白水平檢測

分別選取小鼠子宮內(nèi)膜組織約100 mg，與提取組織RNA方法類似，將子宮組織勻漿化，隨后加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA裂解液對內(nèi)膜組織進行蛋白裂解并均質(zhì)化處理，置于冰塊30 min，然后高速離心并取上清液，使用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白水平，于超低溫冰箱保存蛋白以備用。按說明書提前制備SDS聚丙烯酰胺，取50 μg蛋白與適量緩沖液均勻混合，于95 ℃使蛋白變性，然后進行上樣處理。跑濃縮膠的電壓為60 V，進入分離膠電壓為120 V，當溴酚藍染料到達分離膠底端時可以結(jié)束凝膠電泳實驗。把分離膠放置于轉(zhuǎn)移緩沖液中緩沖15 min，將大小合適的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜提前放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。用轉(zhuǎn)移緩沖液小心浸透6塊大小合適的Whatman 3 mm濾紙。將濾紙、凝膠、PVDF膜從上到下放置，然后表面再放置3張濾紙，電流設置為270 mA，轉(zhuǎn)移時間長達2 h。轉(zhuǎn)移實驗結(jié)束后，通過質(zhì)量分數(shù)為0.1% PBST溶液清洗PVDF膜，然后加入體積分數(shù)為5%的封閉溶液，在室溫條件下緩慢震蕩1 h。往含PVDF膜的盒中放入比例均為1∶1 000的單克隆鼠抗IASPP和β-actin封閉液，放置4℃冰箱中緩慢震蕩過夜。通過PBS緩沖液洗滌清洗PVDF膜5 min，重復2次。把PVDF膜放入干凈的盒中，加入被HRP標記且比例為1∶3 000的羊抗小鼠IgG抗體，在室溫條件下緩慢震蕩1 h，通過質(zhì)量分數(shù)為0.1% PBST緩沖液洗滌清洗PVDF膜20 min，重復2次。通過ECL法觀察目的蛋白的條帶，利用Quantity One軟件定量測量。

1.3.4 免疫組織化學檢測

選取合適的石蠟切片，脫蠟后置于體積分數(shù)為3%的雙氧水中15 min，清除子宮組織內(nèi)的內(nèi)源性過氧化物酶，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的 PBST緩沖液修復子宮組織的抗原，加入封閉液(體積分數(shù)10%的山羊血清)對切片于37 ℃封閉處理15 min，棄去封閉液，緩慢加入兔抗人IASPP單克隆抗體(稀釋比例為1∶80)，于4 ℃孵育過夜。后加入生物標記的羊抗兔IgG標準液，室溫孵育30 min，清洗后用辣根過氧化物酶對鏈霉卵白素工作液標記處理，室溫孵育1 h后DAB顯色。以上各操作步驟之間均需要使用質(zhì)量分數(shù)0.1% PBST清洗，并重復2次，使用蘇木精染料對子宮組織進行染色處理，對切片進行徹底脫水和透明處理并封片和固定。本研究中將PBS緩沖液替代一抗試劑，并設為本研究的陰性對照組。通過HAIPS-1000高清彩色病理圖像測量系統(tǒng)對子宮組織進行觀察，被納入的陽性平均值(A值)作為本研究的半定量參數(shù)，從而對IASPP蛋白分泌水平進行定量分析。分別隨機選取未孕組小鼠和處于不同妊娠階段的孕鼠的子宮組織切片，每張子宮組織切片隨機選取著色典型的視野進行對比。

1.3.5 小鼠子宮角注射法

選取妊娠周期為4 d的雌性小鼠共20只，然后隨機劃分成2組，用5 μL兔血清IgG分別注射對照組小鼠的左側(cè)和右側(cè)子宮角，實驗組則對小鼠的左側(cè)子宮角注射1∶80的p53凋亡刺激蛋白抑制因子單克隆抗體5 μL，注入5 μL兔血清IgG至右側(cè)子宮角。然后在小鼠孕期的第8天后進行剖腹快速將子宮從小鼠體內(nèi)剝離，詳細記錄子宮胚胎著床數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學分析

計算IASPP在妊娠0、2、3、4、5、6、7天各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達；計算胚胎著床數(shù)。獲得的實驗數(shù)據(jù)被EPidata3.1軟件進行雙錄入處理，通過SPSS 25.0軟件(IBM, 紐約)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料通過均數(shù)±標準差進行表示，通過卡方檢驗以及兩獨立樣本的t檢驗對數(shù)據(jù)的組間進行比較，P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 IASPP mRNA水平

實時熒光定量PCR實驗顯示，IASPP的轉(zhuǎn)錄水平隨時間推移而緩慢升高，mRNA的表達水平Day0為(1.12±0.04)，Day2為(0.85±0.28),Day3為(0.94±0.47)，并且于雌鼠動情周期的第4天到達峰值(1.97±1.06)(P<0.05)，然后該水平緩慢降低，Day5為(1.30±0.38)， Day6降為(1.28±0.17)，Day7進一步降為(0.72±0.18)。以上實驗均重復3次，與其他組別相比，D4存在明顯差異(P<0.05)，見圖1。

1)P<0.05

2.2 IASPP的Western blot分析

Western blot實驗結(jié)果表明，IASPP的蛋白水平隨時間推移而緩慢增加，在雌鼠動情周期的第5天到達峰值(P<0.05)，然后緩慢降低。以上均重復3次，與其他組別相比，D5存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖2及圖3。

圖2 Western blot實驗檢測雌鼠子宮內(nèi)膜中IASPP蛋白水平

1)P<0.05

2.3 IASPP蛋白的組織學定位及表達

早孕小鼠子宮腔上皮、腺上皮的胞膜和胞漿、血管內(nèi)皮以及基質(zhì)細胞的細胞核中分泌IASPP蛋白，經(jīng)染色呈棕黃色顆粒狀，同時各個妊娠階段的陽性反應存在差異，未孕組也顯示弱陽性(圖4中：紅色箭頭指示上皮細胞，綠色箭頭指示間質(zhì)細胞)。

如表2，除了血管上皮細胞第0天，管腔上皮細胞、基質(zhì)細胞及腺體上皮細胞在孕期均有IASPP陽性表達，且呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，但均在第7天出現(xiàn)下降，表現(xiàn)為第0天和第7天陽性反應最弱。

A:動情間期，B:動情后期，C、D、E、F、G、H:分別為孕2～7 d的表達A: The period of estrus, B: The later period of estrus, C, D, E, F, G, H: The expression of 2～7 days of pregnancy

表2 IASPP在妊娠期間表達強度的分布

2.4 IASPP對小鼠胚胎著床的影響

對孕第8天小鼠子宮的胚胎著床數(shù)進行準確統(tǒng)計分析，實驗組小鼠的左側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)是(1.402±0.517)，右側(cè)為(6.420±1.075)，對照組子宮胚胎著床數(shù)左側(cè)為(6.500±1.090)，對照組右側(cè)為(6.200±0.919)，實驗組小鼠的左側(cè)胚胎著床數(shù)與右側(cè)胚胎著床數(shù)相比，呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(P<0.05)，對照組小鼠的左側(cè)和右側(cè)的子宮胚胎著床數(shù)目的差異不明顯(P>0.05)。

3 討論

胚胎著床作為哺乳動物關(guān)鍵的生殖環(huán)節(jié)，其基礎是子宮內(nèi)膜的接受性[4]，小鼠受精后4～5 d子宮內(nèi)膜狀態(tài)和包容性達到最佳[5]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜時，蛻膜細胞經(jīng)歷的增殖和凋亡的生理活動均是在不依賴胚胎的形式下進行，但對其分子調(diào)控機制仍未明確[6]。IASPP與ASPP1/ASPP2同屬于P53結(jié)合蛋白家族的成員。當人體基因組發(fā)生損壞時，p53基因能阻滯細胞周期或誘導細胞凋亡以抑制細胞產(chǎn)生癌變[7]，IASPP與p53基因結(jié)合后有遏制p53誘導的細胞凋亡的作用[8]，目前相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、肝細胞癌、子宮內(nèi)膜癌和急性白血病等惡性腫瘤中均具有較高的IASPP表達[9]，但關(guān)于IASPP的表達對胚胎著床的作用研究相對較少。因此，基于IASPP參與細胞凋亡調(diào)節(jié)的特性，子宮內(nèi)蛻膜細胞的增殖與凋亡會進一步影響胚胎著床而展開此項研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，早孕小鼠子宮腔上皮、腺上皮的胞膜和胞漿、血管內(nèi)皮以及基質(zhì)細胞的細胞核中分泌IASPP蛋白，經(jīng)染色呈棕黃色顆粒狀，同時各個妊娠階段的陽性反應存在差異，雖然未孕組也顯示弱陽性，但表達較低。以上結(jié)果說明IASPP蛋白的分泌，能明顯抑制子宮內(nèi)蛻膜細胞的細胞凋亡程序，有利于蛻膜細胞的生成，至小鼠孕期第7天時IASPP的表達水平開始降低，啟動蛻膜細胞的凋亡，形成一個完整的周期，與許萍等[10]研究結(jié)果一致，提示IASPP在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，參與蛻膜細胞的形成。本研究還發(fā)現(xiàn)，除了血管上皮細胞在未孕期(第0天)外，管腔上皮細胞、基質(zhì)細胞和腺體上皮細胞在孕期內(nèi)均有IASPP陽性表達，且呈隨時間推進逐漸增強的趨勢，并在第7天開始下降，表現(xiàn)為第0天和第7天表達最弱。文獻研究表明這是由于機體內(nèi)的滋養(yǎng)細胞不停地生長、發(fā)育、轉(zhuǎn)移，并逐漸定植于小鼠的子宮內(nèi)膜，以達到營養(yǎng)胚胎的目的[11]。子宮角注射實驗的小鼠胚胎著床率的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠位于左側(cè)的胚胎著床數(shù)明顯低于右側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)，而對照組小鼠左右兩側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)未出現(xiàn)明顯差別，說明IASPP單克隆抗體對小鼠胚胎著床具有明顯的抑制作用，但不能達到完全抑制作用。這與孟君等[12]的報道類似：增殖細胞核抗原(PCNA)作為與細胞DNA合成密切相關(guān)的增殖細胞核抗原，其單克隆抗體具有顯著減少胚泡著床數(shù)的功能，據(jù)此推測IASPP可能是通過IASPP對DNA聚合酶的作用，致使DNA復制減少并阻礙子宮內(nèi)膜細胞的增殖與分化，影響子宮內(nèi)膜蛻膜化后削減子宮內(nèi)膜對胚泡的黏附，使蛻膜細胞的增殖與凋亡間動態(tài)平衡遭到破壞，影響胚胎順利著床，但具體的機制還需要進一步探究。

綜上所述，早孕小鼠子宮內(nèi)膜組織中p53凋亡刺激蛋白抑制因子IASPP持續(xù)表達，并參與小鼠胚胎的著床調(diào)控過程。

作者貢獻聲明

李娜：提出研究思路和框架，實驗操作，撰寫并修改論文；苗聰秀：指導實驗，修改論文；李莉娜：指導實驗，實施操作，數(shù)據(jù)分析；馬甜思：統(tǒng)計分析；苗卉：數(shù)據(jù)收集及分析。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。