抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白表達(dá)和通道功能的影響

梁沛彰?顏茹芳?張永華?黃煥森?汪靈芝

【摘要】目的 探討3種不同機(jī)制抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白和通道功能的影響。方法 CCK-8實驗檢測不同機(jī)制抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性，采用蛋白免疫印跡法和細(xì)胞接種熒光示蹤法測定3種不同機(jī)制抗抑郁藥對由縫隙連接蛋白43（Cx43）組成的通道功能和Cx43蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 CCK-8實驗顯示，25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞無細(xì)胞毒性（P均> 0.05）; 25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛能抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的熒光傳遞功能（P均< 0.05），但3種抗抑郁藥均不影響海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá)（P均> 0.05）。結(jié)論 抗抑郁藥能夠顯著降低海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的通道功能。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞縫隙連接;星形膠質(zhì)細(xì)胞;海馬;抗抑郁藥;縫隙連接蛋白43

Influence of antidepressants on connexin expression and gap junction function of hippocampal astrocytes Liang Peizhang， Yan Rufang， Zhang Yonghua， Huang Huansen， Wang Lingzhi. Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Wang Lingzhi， E-mail： wlz4009@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the effects of three antidepressants with different mechanisms on connexin expression and channel function of hippocampal astrocytes. Methods The cytotoxicity of antidepressants with different mechanisms on hippocampal astrocytes was assessed by CCK-8 assay. The effects of three antidepressants with different mechanisms on gap junction function and the expression level of connexin 43 protein （Cx43） were determined by cell inoculation fluorescence tracing and western blot. Results CCK-8 assay showed that 25.00 ?mol/L fluoxetine， 0.10 ?mol/L amitriptyline and 0.20 nmol/L

venlafaxine had no cytotoxicity on hippocampal astrocytes （all P > 0.05）. In addition， 25.00 ?mol/L fluoxetine， 0.10 ?mol/L amitriptyline and 0.20 nmol/L venlafaxine could significantly inhibit the fluorescence transfer function of gap junction in hippocampal astrocytes （all P < 0.05）， whereas three antidepressants exerted on effects upon the expression of Cx43 in hippocampal astrocytes （all P > 0.05）. Conclusion Antidepressants can significantly reduce the gap junction function composed of Cx43 in hippocampal astrocytes.

【Key words】Gap junction; Astrocyte; Hippocampus; Antidepressant;connexin 43 protein

作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，海馬不僅參與學(xué)習(xí)、記憶與情感活動功能調(diào)控，同時在抑郁癥心境障礙的產(chǎn)生演化過程扮演重要的作用。海馬區(qū)富含星形膠質(zhì)細(xì)胞。研究顯示，抑郁癥可以導(dǎo)致海馬體積的變化，同時星形膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生變化[1-2]。多種抗抑郁藥可通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)揮作用。盡管近年來越來越多的研究證實星形膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[3-4]。

但目前為止，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與抑郁癥的具體機(jī)制仍不清楚，哪些分子可以成為抗抑郁藥的靶點還有待探究。細(xì)胞縫隙連接（GJ）是廣泛存在于各種實質(zhì)性器官組織細(xì)胞之間的一類蛋白質(zhì)連接通道。每6個連接蛋白（Cx）在細(xì)胞膜上作為連接子圍繞一起形成單個“半通道”。位于相鄰細(xì)胞膜上2個相對應(yīng)的“半通道”結(jié)合成1個完整的GJ。研究發(fā)現(xiàn)，<1 kDa的小分子物質(zhì)（細(xì)胞信號分子和代謝物質(zhì)如離子、糖等）可通過GJ快速轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散到相鄰接的細(xì)胞。GJ是信息物質(zhì)在細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞的一個重要節(jié)點。目前為止，人體中共發(fā)現(xiàn)有21種Cx，分別以其分子量進(jìn)行命名。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)的Cx為Cx43[5-6]。近年研究證實，星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43蛋白及其組成的通道功能異?？赡芘c抑郁癥密切相關(guān)[7]。我們通過前期的實驗證實，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白通道參與了抑郁情緒障礙，但抗抑郁藥是否影響海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)和通道功能至今未見報道。為此進(jìn)行本研究，探討3種不同機(jī)制抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)GJ蛋白和通道功能的影響，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、細(xì)胞來源和試劑

原代星形膠質(zhì)細(xì)胞取材于清潔級2～3 d的無特定病原體（SPF）大鼠乳鼠，大鼠乳鼠購于廣東省動物實驗中心。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號：B2021-022）。本課題中采用的實驗試劑：青霉素、鏈霉素、胰酶、DMEM干粉和胎牛血清等購于美國Gibco公司，氟西汀、阿米替林和文拉法辛購于上海麥克林生化科技有限公司，CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司， Calcine-AM購于Invitrogen -Thermo fisher公司，Cx43羊抗鼠單克隆抗體和β-actin羊抗鼠單克隆抗體購于美國Sigma公司，二抗購于Abcam公司。

二、方 法

1. 星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化和培養(yǎng)

取2～3 d的SPF大鼠乳鼠5只，低溫麻醉后打開顱骨，取出大腦，置于含預(yù)冷DMEM的培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下取出海馬，分離星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后輕搖換液1次，去除死亡的細(xì)胞碎片，2～3 d換液1次，細(xì)胞培養(yǎng)7～9 d，置37 ℃恒溫?fù)u床搖振過夜（200 轉(zhuǎn)/分，16 h），棄上清后貼壁較牢的為星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化星形膠質(zhì)細(xì)胞，重懸后采用高糖DMEM 培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)和傳代星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗[8]。

2. CCK-8實驗檢測抗抑郁藥對星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用

在96孔板中，接種原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞（1000個/孔），3種抗抑郁藥氟西汀、阿米替林、文拉法辛參考既往文獻(xiàn)報道設(shè)置不同的藥物濃度組別，每組設(shè)置4孔，分別加入200 μL培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后通過 CCK-8試劑盒對細(xì)胞的活力進(jìn)行測定，通過酶標(biāo)儀于490 nm檢測各孔的吸光度（D）值，根據(jù)公式：

細(xì)胞存活率=（D實驗孔-D空白孔）/（D對照孔-D空白孔）

×100%

計算抗抑郁藥對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，重復(fù)上述實驗3次，結(jié)果取平均值。

3. 蛋白免疫印跡法檢測Cx43在海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法，裂解細(xì)胞獲取蛋白，并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較進(jìn)行目標(biāo)蛋白定量（Bio-rad DC蛋白定量試劑盒），制備電泳凝膠，20 μg蛋白進(jìn)行上樣，Bio-Rad電泳儀電泳，轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗（抗Cx43單克隆抗體，1∶6000;抗β-actin單克隆抗體，1∶8000），二抗孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，ECL發(fā)光試劑孵育。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)收集圖像，用生物圖像系統(tǒng)（Gene Genius）分別對Cx43和β-actin條帶進(jìn)行灰度掃描分析。

4. 細(xì)胞接種熒光示蹤法檢測海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ 熒光傳遞功能

由于綠色熒光試劑Calcine-AM進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)酶解后不能自由通過細(xì)胞膜但能通過GJ進(jìn)入鄰接細(xì)胞，以倒置熒光顯微鏡計數(shù)通過GJ染上綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，檢測GJ功能。取星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)3～4 d后待細(xì)胞相互融合，通過將Calcine-AM試劑與細(xì)胞共同孵育使該細(xì)胞染有綠色熒光，將該細(xì)胞定義為 “供體細(xì)胞”。將經(jīng)胰酶消化后的“供體細(xì)胞”接種至經(jīng)不同抗抑郁藥處理過的融合星形膠質(zhì)細(xì)胞上，供體細(xì)胞接種4 h待與周圍細(xì)胞融合，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過穩(wěn)定的GJ（綠色熒光），由“供體細(xì)胞”進(jìn)入鄰接細(xì)胞。通過倒置熒光顯微鏡，計數(shù)一個“供體細(xì)胞”周圍含有綠色熒光的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目， 作為檢測GJ功能的指標(biāo)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以? 表示，不同組與對照組間比較采用方差分析和Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性

為了排除抗抑郁藥的細(xì)胞毒性影響細(xì)胞數(shù)量，從而對GJ功能產(chǎn)生影響，本研究首先用CCK-8法檢測3種抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響。與對照組相比，50.00 μmol/L氟西汀，1.00、10.00和100.00 μmol/L阿米替林及20.00 nmol/L文拉法辛的細(xì)胞活力下降（P均< 0.05），表明藥物在這些濃度下能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長，見表1。因此，后續(xù)實驗中選取該3種抗抑郁藥無細(xì)胞毒性的較高濃度進(jìn)行研究，即25.00 μmol/L氟西汀、0.10 μmol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛。

二、抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法顯示，與對照組比較，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43在25.00 ?mol/L氟西汀、0.10 ?mol/L阿米替林和0.20 nmol/L文拉法辛作用下未影響其表達(dá)。對各組條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析（內(nèi)參照為β-actin 灰度值），組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見圖1。

三、抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的GJ通道功能的影響

細(xì)胞接種熒光示蹤顯示（圖2），與對照組相比，25 ?mol/L氟西汀能夠降低海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（46±2）%;0.1 ?mol/L阿米替林能夠降低熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（66±3）%;0.20 nmol/L文拉法辛能夠降低海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光傳遞功能，熒光傳遞功能約為對照組的（62±3）%，氟西汀與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;阿米替林和文拉法辛與對照組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05），表明3種抗抑郁藥均可以降低海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞由Cx43所組成的GJ功能。

討論

抑郁癥是一類嚴(yán)重的心境障礙，心境低落為抑郁癥的顯著特征，情緒低落、興趣減退、活動減少的“三低”癥狀為抑郁癥的主要臨床表現(xiàn)。抑郁癥影響全球3.8%的人口，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚[9]。腦內(nèi)去甲腎上腺素和5-羥色胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平低下被認(rèn)為與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，目前經(jīng)典的抗抑郁藥在臨床上的應(yīng)用仍存在療效滯后，重癥患者通過藥物或聯(lián)合心理治療后仍會出現(xiàn)抗治療反應(yīng)和易復(fù)發(fā)等問題[10-12]。近年多項研究顯示，廣泛存在于神經(jīng)元周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥患者和動物模型中有形態(tài)和功能的改變，同時還伴隨谷氨酸受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常[3， 13]。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥帕羅西汀和單胺氧化酶抑制劑氯丙咪嗪能夠明顯增加抑郁模型大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GFAP的表達(dá)。研究者認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是抑郁癥發(fā)生的根本原因，而針對星形膠質(zhì)細(xì)胞的治療有望成為潛在的治療靶點[15]。

抑郁癥的發(fā)生伴隨腦內(nèi)多個部位（皮質(zhì)、海馬、杏仁核等）的結(jié)構(gòu)和功能異常。海馬是邊緣系統(tǒng)的主要組成部分，是學(xué)習(xí)、情感和記憶等高級神經(jīng)活動的重要腦區(qū)。抑郁癥可導(dǎo)致海馬體積的變化、神經(jīng)突觸可塑性改變，興奮性氨基酸、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常和神經(jīng)營養(yǎng)因子等表達(dá)下調(diào)[1]。在多種不同應(yīng)激模式導(dǎo)致的抑郁動物模型中，研究者發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)發(fā)生異常[2]。氟西汀在臨床上廣泛應(yīng)用，通過選擇性抑制5-羥色胺再攝取發(fā)揮作用。阿米替林是三環(huán)類抗抑郁藥，是第一代單胺氧化酶再攝取抑制劑。文拉法辛是苯乙胺的衍生物，通過抑制5-羥色胺與去甲腎上腺素再攝取發(fā)揮作用。本研究通過CCK-8實驗證實3種不同機(jī)制的抗抑郁藥氟西汀、阿米替林和文拉法辛在一定濃度范圍內(nèi)對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞無抑制作用。蛋白免疫印跡法和熒光示蹤法結(jié)果首次證實3種抗抑郁藥均能夠明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的GJ功能，但不影響Cx43蛋白表達(dá)。既往研究通過細(xì)胞劃痕實驗證實氟西汀、阿米替林和文拉法辛等抗抑郁藥能夠明顯抑制小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的GJ功能，但不影響Cx43蛋白表達(dá)[16]。但其并未就抗抑郁藥對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ功能進(jìn)行研究。組織細(xì)胞微環(huán)境中酸堿值、游離鈣離子、細(xì)胞膜電位、連接蛋白磷酸化等多種因素可影響GJ的開放與閉合狀態(tài)。研究表明Cx43的磷酸化能夠?qū)е翯J功能改變[17]。Quesseveur等[18]報道，長期給予糖皮質(zhì)激素的小鼠出現(xiàn)的抑郁樣行為伴隨海馬Cx43磷酸化增多，而應(yīng)用抗抑郁藥氟西汀能夠明顯減少Cx43磷酸化和抑郁樣癥狀。由此推測，抗抑郁藥對GJ功能的影響可能與其磷酸化的改變有關(guān)，但仍需后續(xù)研究證實。

Cx及其組成通道與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切。研究者在抑郁癥患者的尸檢結(jié)果以及急性、慢性應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁模型上均發(fā)現(xiàn)大腦 Cx43 表達(dá)的改變[19]。同時動物研究還顯示，抗抑郁藥可通過影響海馬或者前額葉Cx43蛋白或半通道的功能在慢性應(yīng)激或者糖皮質(zhì)激素慢性給藥引起的抑郁大鼠中產(chǎn)生抗抑郁作用[20]。這些研究結(jié)果均表明，皮質(zhì)或額葉的星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白及組成通道在抑郁癥的發(fā)生過程中具有極其重要的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥能夠明顯改變海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的GJ功能，這提示海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43可能在抑郁癥發(fā)生中起重要的作用。區(qū)別于以往主要針對神經(jīng)元為靶點的藥物開發(fā)，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞有望成為新的治療靶點。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Zarate-Garza P P， Ortega-Balderas J A， Ontiveros-Sanchez de la Barquera J A， et al. Hippocampal volume as treatment predictor in antidepressant na?ve patients with major depressive disorder. J Psychiatr Res， 2021， 140： 323-328.

[2] Czéh B， Simon M， Schmelting B， et al. Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment. Neuropsychopharmacology， 2006， 31（8）： 1616-1626.

[3] Li Y， Luo Y， Tang J， et al. The positive effects of running exercise on hippocampal astrocytes in a rat model of depression. Transl Psychiatry， 2021， 11（1）： 83.

[4] Ferreira F R， Cupido A， Catalin B， et al. Astrocyte intracellular Ca2+ and TrkB signaling in the hippocampus could be involved in the beneficial behavioral effects of antidepressant treatment. Neurotox Res， 2021， 39（3）： 860-871.

[5] Wang L， Peng Y， Peng J， et al. Tramadol attenuates the sensitivity of glioblastoma to temozolomide through the suppression of Cx43?mediated gap junction intercellular communication. Int J Oncol， 2018， 52（1）： 295-304.

[6] Fumagalli A， Heuninck J， Pizzoccaro A， et al. The atypical chemokine receptor 3 interacts with connexin 43 inhibiting astrocytic gap junctional intercellular communication. Nat Commun， 2020， 11（1）： 4855.

[7] Okada M， Oka T， Nakamoto M， et al. Astroglial connexin 43 as a potential target for a mood stabiliser. Int J Mol Sci， 2020， 22（1）： 339.

[8] 張楠， 熊文雯， 邢媛， 等. 大鼠海馬神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng). 神經(jīng)藥理學(xué)報， 2017， 7（1）： 24-28.

[9] Mathers C D， Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS Med， 2006， 3（11）： e442.

[10] 高宇博，李亮萍，朱心紅，等. 抑郁神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究新進(jìn)展. 生理學(xué)報，2012，64（4）：475-480.

[11] 周素妙， 黃興兵. 氧化應(yīng)激參與抑郁癥認(rèn)知功能障礙機(jī)制的研究進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué)， 2019， 50（12）： 877-880.

[12] 陳怡， 梁其生， 葉偉健， 等. 支持性心理治療對復(fù)發(fā)老年抑郁癥患者抑郁癥狀及生活質(zhì)量的影響. 新醫(yī)學(xué)， 2013， 44（3）： 184-187.

[13] Rubinow M J， Mahajan G， May W， et al. Basolateral amygdala volume and cell numbers in major depressive disorder： a postmortem stereological study. Brain Struct Funct， 2016， 221（1）： 171-184.

[14] Liu Q， Li B， Zhu H Y， et al. Clomipramine treatment reversed the glial pathology in a chronic unpredictable stress-induced rat model of depression. Eur Neuropsychopharmacol， 2009， 19（11）： 796-805.

[15] Shu X， Sun Y， Sun X， et al. The effect of fluoxetine on astrocyte autophagy flux and injured mitochondria clearance in a mouse model of depression. Cell Death Dis， 2019， 10（8）： 577.

[16] Jeanson T， Pondaven A， Ezan P， et al. Antidepressants impact connexin 43 channel functions in astrocytes. Front Cell Neurosci， 2016， 9： 495.

[17] Wang L， Peng J， Huang H， et al. Simvastatin protects Sertoli cells against cisplatin cytotoxicity through enhanced gap junction intercellular communication. Oncol Rep， 2015， 34（4）： 2133-2141.

[18] Quesseveur G， Portal B， Basile J A， et al. Attenuated levels of hippocampal connexin 43 and its phosphorylation correlate with antidepressant- and anxiolytic-like activities in mice. Front Cell Neurosci， 2015， 9： 490.

[19] Nagy C， Torres-Platas S G， Mechawar N， et al. Repression of astrocytic connexins in cortical and subcortical brain regions and prefrontal enrichment of H3K9me3 in depression and suicide. Int J Neuropsychopharmacol， 2017， 20（1）： 50-57.

[20] Sun J D， Liu Y， Yuan Y H， et al. Gap junction dysfunction in the prefrontal cortex induces depressive-like behaviors in rats. Neuropsychopharmacology， 2012， 37（5）：1305-1320.

（收稿日期：2021-09-16）

（本文編輯：林燕薇）