基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制分析

張毅 黃雯 盧僖

摘要：目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制。方法：通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺，獲取四君子湯的活性成分及作用靶點(diǎn);利用GeneCards和Disgent數(shù)據(jù)篩選出心肌肥厚疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將兩者取交集，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò);利用String11.5獲得PPI蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò);使用R語言進(jìn)行GO、KEGG基因富集分析，獲得四君子湯干預(yù)心肌肥厚的潛在信號通路。結(jié)果：篩選出四君子湯有效活性成分136個，作用靶點(diǎn)254個;心肌肥厚疾病相關(guān)靶點(diǎn)4015個;四君子湯與心肌肥厚共同作用靶點(diǎn)160個;PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析后得到TNF，IL-1β和IL-6等關(guān)鍵靶點(diǎn);GO基因富集分析主要富集在藥物反應(yīng)，細(xì)胞因子等相關(guān)的生物過程;KEGG通路分析主要集中在PI3K-AKT，TNF，MAPK以及HIF-1信號通路上。結(jié)論：四君子湯可能通過靶向TNF，IL-1β和IL-6等核心靶點(diǎn)達(dá)到干預(yù)心肌肥厚的作用，其機(jī)制與調(diào)控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應(yīng)激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);四君子湯;心肌肥厚

【中圖分類號】R542.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）08--02

心肌肥厚（hypertrophiccardiomyopathy）是心肌組織超負(fù)荷的一種代償性反應(yīng)，主要特征為心肌細(xì)胞體積增大，蛋白合成增加以及間質(zhì)成分改變，是引起多種心血管疾病如心率失常，心衰和心源性猝死發(fā)病率和病死率升高的獨(dú)立危險因素之一[1]。

四君子湯來源于宋《太平惠民和劑局方》，為益氣，健脾，化痰的代表方劑，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，具有補(bǔ)氣，益氣健脾之功效。研究表明，四君子湯可以改善慢性左心衰模型大鼠的心功能，緩解心力衰竭患者的臨床癥狀，提高心功能、延緩心室重構(gòu)，改善生活質(zhì)量及預(yù)后[2]，但其治療心肌肥厚的有效活性成分及作用機(jī)制仍不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以網(wǎng)絡(luò)信息為平臺，分析藥物-疾病-靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的新興學(xué)科。其整體性和系統(tǒng)性以及注重藥物與靶點(diǎn)以及疾病相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)的研究理念不謀而合。為了明確四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對四君子湯治療心肌肥厚的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，并通過分子對接對藥物的主要的活性成分和潛在靶點(diǎn)間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，初步闡明四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1四君子湯活性成分收集與篩選

四君子湯包含人參、白術(shù)、茯苓、甘草四味中藥，將這四味中藥分別以中文名稱作為關(guān)鍵詞，輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進(jìn)行檢索以其參數(shù)中的口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為限制條件進(jìn)行篩選，篩選后獲得有效化學(xué)成分作為四君子湯的活性成分。再根據(jù)相應(yīng)的活性成分尋找與之對應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2四君子湯中活性成分潛在靶點(diǎn)與心肌肥厚的疾病靶點(diǎn)預(yù)測

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺得到的四君子湯的成分靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將相應(yīng)的蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)化為Genesymbol。利用GeneCardsandDisgent數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/和https：//www.disgenet.org/），以“hypertrophiccardiomyopathy”為關(guān)鍵詞搜索，得到心肌肥厚相關(guān)的靶點(diǎn)，在刪除其重復(fù)的靶點(diǎn)后，利用韋恩圖將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行求交集作為“Hub”靶點(diǎn)，即四君子湯治療心肌肥厚的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了明確藥物是通過哪些成分及靶點(diǎn)作用于心肌肥厚的，我們利用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化的構(gòu)建。

1.4靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）構(gòu)建

將四君子湯治療心肌肥厚的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.5數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org），并將其物種限定為“homosapiens”，設(shè)置置信度≥0.4，同時去除孤立的靶點(diǎn)蛋白，得到蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，通過NetworkAnalyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析從而獲得Degree值，從而確定該網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5GO功能及KEGG通路富集分析

將四君子湯對心肌肥厚的潛在作用靶標(biāo)基因利用R語言Clusterprofiler程序進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定P≤0.05得到相應(yīng)的生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）以及KEGG信號通路。利用R語言pathview功能將GO富集的前12條條目及前20條信號通路制成氣泡圖。

2.結(jié)果

2.1四君子湯候選活性成分及候選靶標(biāo)蛋白篩選

將人參、白術(shù)、茯苓和甘草作為關(guān)鍵詞分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索后，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18的候選化合物共得到136個成分，其中人參22個、白術(shù)7個、茯苓15個、甘草92個。然后將對應(yīng)的化合物分子查詢相關(guān)蛋白，將所有蛋白全稱經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化。在刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，共計獲得254個靶點(diǎn)蛋白。這表明四君子湯是通過多靶點(diǎn)的協(xié)同作用發(fā)揮功能的。

2.2四君子湯活性成分治療心肌肥厚的潛在靶點(diǎn)蛋白信息

在GeneCard和Disgenet數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“hypertrophiccardiomyopathy”，結(jié)果得到相關(guān)基因共4015個。將4015個疾病相關(guān)基因和254個藥物潛在靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取兩者之間的交集基因160個（圖1 A），進(jìn)一步通過Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建四君子湯-靶點(diǎn)-心肌肥厚關(guān)系圖（圖1B），提示四君子湯對心肌肥厚的治療作用可能與這160個交集靶點(diǎn)有關(guān)。

2.3蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析（PPI）

我們進(jìn)一步將得到的160個共同作用靶點(diǎn)上傳至String11.5數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)信息，通過將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，再按“degree”值進(jìn)行排序，得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2A）。該網(wǎng)絡(luò)由160個節(jié)點(diǎn)，3318條邊組成，其中degree值前10的蛋白靶點(diǎn)包括VEGFA，CASP3，HIF1A，AKT1，EGFR，TP53，JUN，TNF，IL-1β和IL-6（圖2B），提示它們可能是四君子湯作用于心肌肥厚的核心靶點(diǎn)。

2.4靶蛋白的富集分析

2.4.1GO富集分析

為了進(jìn)一步明確160個靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)功能，將藥物-疾病的共同靶點(diǎn)輸入R語言Clusterprofiler程序中，分別進(jìn)行分子功能（GOmolecularfunctions）、生物途徑功能（GObiologicalprocesses）和細(xì)胞成分（GOcellularcomponents）三個方面的GO富集分析，根據(jù)Count值由大到小，同時滿足p<0.05進(jìn)行排序，分別在BP、MF和CC中選出排名前12的條目制作條形圖。結(jié)果顯示四君子湯與心肌肥厚交集基因在生物過程BP顯著富集在RNA轉(zhuǎn)錄，藥物反應(yīng)，細(xì)胞凋亡和增殖等（圖3）。分子功能MF主要富集在蛋白結(jié)合，酶結(jié)合，細(xì)胞因子活性等。細(xì)胞組成CC主要富集在細(xì)胞外液，質(zhì)膜，細(xì)胞液等中。

將藥物-疾病共同作用的160個靶點(diǎn)輸入R語言Clusterprofiler程序中KEGG通路富集分析得到163條通路，選取P值小和Count值較大的前20的通路，按GeneRatio大小順序排列進(jìn)行可視化。由KEGG富集分析結(jié)果可知，四君子湯治療心肌肥厚的作用途徑與信號通路是復(fù)雜多樣的，最有可能與細(xì)胞增殖PI3K-AKT，炎癥相關(guān)的TNF，代謝相關(guān)的MAPK以及低氧應(yīng)激HIF-1信號通路相關(guān)（圖4）。

四君子湯是益氣健脾的基礎(chǔ)方，其組方中包含人參，茯苓，白術(shù)，炙甘草四味中藥。方中人參甘溫扶脾養(yǎng)胃，大補(bǔ)元?dú)鉃榫帲仔g(shù)苦溫，燥濕健脾為臣藥，茯苓甘淡，健脾祛濕為佐藥，甘草甘溫，益氣和中，調(diào)和諸藥，為佐使之藥[3]。研究篩選出四君子湯有效活性成分136個，可作用于心肌肥厚的作用靶點(diǎn)160個，這與中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)疾病的特性相吻合。心肌肥厚的發(fā)生與機(jī)械性、神經(jīng)體液、內(nèi)分泌、交感神經(jīng)系統(tǒng)活性、細(xì)胞因子、一氧化氮以及腸道菌群穩(wěn)態(tài)等多種因素相關(guān)提示調(diào)節(jié)內(nèi)分泌或者是腸道穩(wěn)態(tài)能是干預(yù)心肌肥厚的重要方向之一[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡改善心肌線粒體功能等方面，對心肌肥厚發(fā)揮一定的治療作用[5]。由此可見，四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和提高線粒體活性有關(guān)。

本研究對四君子湯治療心肌肥厚的有效成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)排名靠前的是山奈酚、木犀草素和槲皮素等核心化合物，提示這可能是四君子湯干預(yù)心肌肥厚的有效核心成分，而這些藥物都與抗炎和抗氧化有關(guān)[6]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在君子湯干預(yù)心肌肥厚的靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和低氧應(yīng)激HIF-1參與其中，KEGG通路富集分析結(jié)果同樣也提示四君子湯治療心肌肥厚的信號途徑與TNF和HIF-1通路有關(guān)。GO功能富集分析結(jié)果表明共同作用靶點(diǎn)的生物過程主要涉及到細(xì)胞因子等。由此可見，四君子湯治療的心肌肥厚的分子靶點(diǎn)與作用機(jī)制可能與調(diào)控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應(yīng)激活有關(guān)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步分析了四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四君子湯可能通過IL6、IL-1β和HIF-1等靶點(diǎn)起作用，通過對細(xì)胞增殖凋亡和細(xì)胞因子代謝的反應(yīng)等生物過程調(diào)控，以及炎癥相關(guān)的TNF和低氧應(yīng)激HIF-1等信號通路發(fā)揮干預(yù)心肌肥厚的作用。上述結(jié)果為探索四君子湯治療心肌肥厚的作用機(jī)制研究提供理論支撐與科學(xué)依據(jù)。

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