燕麥花藥培養(yǎng)褐化的研究進(jìn)展

田 娟 王春龍 張 曼 孫墨可 董玉迪 郭來春 李春花 魏黎明 加央多拉 任長(zhǎng)忠

（吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 吉林白城 137000）

燕麥?zhǔn)呛瘫究蒲帑湆僖荒晟荼局参铮且环N集營(yíng)養(yǎng)、飼用、藥用于一身的特色雜糧作物。我國(guó)燕麥育種面臨的問題是 “育種技術(shù)單一、方法陳舊、周期長(zhǎng)、優(yōu)良品種少”。通過常規(guī)的品種間雜交，難于突破原有性狀，創(chuàng)造新的類型，而且想要獲得純合品系至少需要連續(xù)自交6～7代。單倍體育種可在較短時(shí)間內(nèi)得到大量純合的個(gè)體，而且加倍單倍體的隱性基因不會(huì)受顯性基因遮蓋而能夠正常表達(dá)，不僅可以顯著縮短育種年限還提高了育種效率。由于影響愈傷組織發(fā)生的因素有很多，燕麥屬植物的花藥培養(yǎng)成功率比較低[1]。在愈傷組織培養(yǎng)過程中，組織褐化、玻璃化和菌類污染統(tǒng)稱植物組織培養(yǎng)的三大難題，控制褐化比控制菌類污染和玻璃化更加困難[2]。組織褐化是指外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化培養(yǎng)過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)以致培養(yǎng)基變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)愈傷組織周圍的培養(yǎng)基也變成褐色，可導(dǎo)致愈傷組織新陳代謝紊亂、細(xì)胞破裂而最終壞死[3]。燕麥花藥組織培養(yǎng)中褐化主要表現(xiàn)在花藥褐變和愈傷組織褐變（未轉(zhuǎn)移時(shí)褐變和轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基后褐變），其影響燕麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)、再分化和生根，嚴(yán)重時(shí)還可使愈傷組織和培養(yǎng)基褐變，從而抑制燕麥花藥培養(yǎng)的正常生理生化反應(yīng)。所以有效的減少褐化是燕麥花藥培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵。結(jié)合近幾年對(duì)燕麥花藥培養(yǎng)的研究及查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)燕麥花藥培養(yǎng)中引起褐化的機(jī)理、褐變產(chǎn)生的影響因素和克服褐變的建議及方法進(jìn)行總結(jié)歸納，針對(duì)燕麥花藥褐化現(xiàn)象對(duì)其以后研究方向進(jìn)行了討論和展望。希望為解決燕麥花藥培養(yǎng)技術(shù)中的褐化問題提供幫助。

1 褐化的機(jī)理

褐變現(xiàn)象按其發(fā)生的機(jī)制分2種，一種是非酶促褐變，另一種是酶促褐變[4]。大多數(shù)的學(xué)者認(rèn)為酶促褐變是外植體組織培養(yǎng)過程中褐變的主要途徑[5]。

1.1 非酶促褐變

植物外植體的非酶促褐變是壞死導(dǎo)致的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)產(chǎn)生。是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡。若采取適當(dāng)措施或外植體適應(yīng)了脅迫環(huán)境則該種褐變現(xiàn)象就不再發(fā)生[6]。

1.2 酶促褐變

植物外植體的酶促褐變是酚類物質(zhì)氧化的結(jié)果。主要由氧化酶類作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的，所以褐化又稱酚污染[7]。YANG等[8]的研究表明，多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）是引起外植體和愈傷組織褐變的2種關(guān)鍵酶，其酶活性相似，并以PPO對(duì)愈傷組織褐變的影響較大。PPO是植物體中普遍存在的一種末端氧化酶，它可以催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，醌類化合物自發(fā)的與組織材料中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合或與其他NH2或SH化合物聚合濃縮而形成褐色產(chǎn)物，引起其他酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂變色，形成黑褐色物質(zhì)，從而引起外植體和愈傷組織褐變[9-12]。其機(jī)理如下：

2 褐變產(chǎn)生的影響因素

在植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象是由多種因素綜合產(chǎn)生的結(jié)果，隨植物的種類、基因型、外植體生長(zhǎng)部位及生理狀態(tài)，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等的不同，褐變的程度也有所不同[13]。燕麥花藥組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象也離不開以上原因。

2.1 基因型

燕麥花藥相比小麥和大麥很容易變褐，主要是因燕麥不同品種的花藥中乙烯的含量不同，抗氧化的能力不同[14]。不同基因型褐化程度也不一樣，有些基因型容易誘導(dǎo)愈傷組織，而有些基因型花藥則易變褐，誘導(dǎo)愈傷組織較困難。所以在選擇花藥培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意這個(gè)問題。

2.2 燕麥花藥生理狀態(tài)

不同生理狀態(tài)的燕麥花藥酚類物質(zhì)的含量及PPO的活性有差異。對(duì)燕麥花藥組織培養(yǎng)而言，供體燕麥植株的生長(zhǎng)環(huán)境，如溫度、水分和光照等對(duì)花藥的活力都有影響，哪一個(gè)因素不符合都能導(dǎo)致燕麥花藥在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐化。燕麥為圓錐花序，同一穗里面的不同小穗發(fā)育時(shí)期也不同，所以采集花藥的時(shí)期、花藥的大小、顏色對(duì)后期培養(yǎng)是否出現(xiàn)褐化也很關(guān)鍵。另外，由于受傷的燕麥花藥其體內(nèi)的多酚氧化酶的活性會(huì)逐漸增高，所以受傷的花藥易發(fā)生褐化。

2.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基既是為外植體提供營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)物質(zhì)，又是細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分和含量、糖的來源和濃度、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比及其他附加物質(zhì)等都可以影響褐變現(xiàn)象的發(fā)生。培養(yǎng)基的pH和硬度的不同也會(huì)對(duì)外植體的褐變有影響。所以選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的成分和濃度及最佳的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等附加物可以有效地克服褐變。

2.4 培養(yǎng)條件

光照和溫度等外界條件對(duì)植物組織培養(yǎng)褐變的影響也至關(guān)重要。因?yàn)闇囟群凸庹諘?huì)影響多酚氧化酶的活性，在高溫或強(qiáng)光環(huán)境中，多酚氧化酶的活性會(huì)提高，醌類物質(zhì)的累積加速，細(xì)胞會(huì)失水死亡，褐色物質(zhì)大量聚集，產(chǎn)生褐變。因此，在植物組織培養(yǎng)初期，愈傷組織的誘導(dǎo)一般會(huì)在避光環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，一旦接觸光照就會(huì)產(chǎn)生褐變。高CO2會(huì)促進(jìn)褐變[15-16]，原因是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，使細(xì)胞內(nèi)積累過多的碳酸根離子，碳酸根離子與細(xì)胞膜上的鈣離子結(jié)合使有效的鈣離子減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)紊亂和瓦解，使酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，發(fā)生褐變。

2.5 其他影響因素

轉(zhuǎn)皿（瓶）時(shí)間早晚也會(huì)影響分化生長(zhǎng)及褐變，在適當(dāng)時(shí)間轉(zhuǎn)皿，不要讓花藥或愈傷組織在一個(gè)地方待得時(shí)間太長(zhǎng)，以防止其分泌的酚類物質(zhì)過多而褐化[9]。

3 克服褐變的方法及建議

3.1 選擇適合的基因型

文獻(xiàn)資料[17-18]表明，在做燕麥花藥組織培養(yǎng)時(shí)對(duì)基因型的依賴性很強(qiáng)。選擇褐變程度較小的燕麥品種可以有效的防止褐化。

3.2 選擇最佳狀態(tài)的燕麥

供體植株的生理?xiàng)l件、內(nèi)源激素水平和花藥組織的營(yíng)養(yǎng)狀況都會(huì)影響褐化發(fā)生，許多基因型的花藥應(yīng)答存在明顯的季節(jié)變化，從田間種植的植物中提取的花藥比從溫室提取的花藥反應(yīng)更好，此外在這個(gè)季節(jié)第一次開花的花藥被發(fā)現(xiàn)反應(yīng)更靈敏[19]。有文獻(xiàn)記載燕麥花藥培養(yǎng)中供體材料的培養(yǎng)要控制一定的溫度，在特定的光照時(shí)間和光照強(qiáng)度下，花藥才會(huì)有反應(yīng)[20]。有研究[14]表明，燕麥在其他條件相同的情況下，緯度不同導(dǎo)致綠苗率不同。所以選擇最佳狀態(tài)的燕麥花藥可以防止褐化。

3.3 選擇適當(dāng)時(shí)期的花藥

花藥培養(yǎng)是獲得雙單倍體生產(chǎn)的首選方法，花粉胚狀體和愈傷組織的形成通常是通過小孢子培養(yǎng)完成的，對(duì)于燕麥來說，誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期是單核中后期至雙核早期，選擇好燕麥花藥的最佳時(shí)期對(duì)防止褐化很重要。常用的燕麥花藥時(shí)期的確定方法有2種，一是鏡檢法[21-22]：選取燕麥幼穗剝離出花藥放在潔凈的載玻片上，然后在花藥上滴一滴染色劑，染色劑最常用的是醋酸楊紅，也可以用龍膽紫、0.3 M甘露醇或者水代替，用玻璃棒敲碎后蓋上蓋玻片，染色5 min后用顯微鏡觀看；二是形態(tài)測(cè)量法：Marzena Warcho等[23]選用4種燕麥為試驗(yàn)材料觀察旗葉基部到倒數(shù)第二葉基部的距離，設(shè)置 0～4.0 cm（A）、4.1～8.0 cm（B）、8.1～12.0 cm（C）、12.1～16.0 cm（D）4個(gè)梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)旗葉基部到倒數(shù)第二葉基部距離0～4 cm最好。一般種植在溫室條件下需5～6周時(shí)間可到這個(gè)時(shí)期，但是不同品種有所不同，具體情況需自己摸索。也可以觀察花藥長(zhǎng)度和花藥顏色，一般花藥長(zhǎng)度2.5 mm（范圍2.0～3.0 mm，因品種而異），常用發(fā)育最好最大的小穗,在一個(gè)小穗里選用最長(zhǎng)最綠的花藥[24]。

3.4 預(yù)處理

適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以減輕花藥褐變。燕麥花藥組織培養(yǎng)中常用的預(yù)處理是冷熱預(yù)處理[25]，將采集的幼穗放在裝有水的燒杯內(nèi)在4℃下保持7 d，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)皿放入32℃的培養(yǎng)箱中熱處理5 d，轉(zhuǎn)移到正常28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。也可以冷熱處理和饑餓處理相結(jié)合[19]，將采集的幼穗放在裝有0.3 M甘露醇的燒杯內(nèi)在4℃下保持7 d后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)皿放入32℃的培養(yǎng)箱中，熱處理5 d后轉(zhuǎn)移到正常28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，甘露醇處理比水處理可以獲得更多的1～2 mm胚胎和產(chǎn)生更多的綠苗和較少白化苗病株。

3.5 選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基

在培養(yǎng)基方面應(yīng)注意適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽成分、糖源及濃度、激素組合與水平，以及配合一些抗褐變劑等都可減輕褐變現(xiàn)象的發(fā)生。

有研究表明Mn2+和Cu2+濃度低時(shí)，外植體的褐化程度輕，燕麥最常用的是改良的W14培養(yǎng)基[26]，可能是因?yàn)樗锩娴腗nSO4·4H2O含量是8 mg/L，較C17（11.2 mg/L）、MS（16.9 mg/L）和 B5（10 mg/L）低，有助于防止花藥褐化。劉藝平等[27]認(rèn)為珊瑚臺(tái)愈傷組織抗褐化效果麥芽糖比蔗糖好。同樣Elina Kiviharju等[28]認(rèn)為在燕麥花藥組織培養(yǎng)中麥芽糖比蔗糖是更好的碳源，改進(jìn)的W14[29]誘導(dǎo)培養(yǎng)基需要一定量的乙烯利和L-半胱氨酸，其中L-半胱氨酸具抗氧化能力，可阻止褐化；Elina Kiviharju等[30]研究誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入高濃度（3～5 mg/L）2,4-D丁酯和低水平的KT，因?yàn)殡m然KT可以影響愈傷組織的質(zhì)量，但是高濃度的KT經(jīng)常造成花藥的褐化，可能與分裂素能促進(jìn)酚類化合物合成或刺激多酚氧化酶的活性有關(guān)。Elina Kiviharju 等[31]將 A（MS+10%蔗糖）和 B（MS+1 mg/L 2,4-D丁酯+10%蔗糖）2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的燕麥花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到E25（2.0 mg/L玉米素+0.1 mg/L TIBA）和 E26（1.0 mg/L TIBA）2 種再生培養(yǎng)基上，結(jié)果在A誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織在E25和E26上都獲得再生植株，但是在B誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織在E26上獲得再生植株，在E25上褐化，說明燕麥花藥愈傷組織褐化不光與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比有關(guān)，也因再生培養(yǎng)基的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同而不同。在燕麥花藥組織培養(yǎng)中，有人[32]認(rèn)為加入活性炭雖然能防止褐化,但是愈傷組織的數(shù)量會(huì)下降，也有人[14]認(rèn)為抗壞血酸和谷胱甘肽還原劑對(duì)防止褐化沒有明確的作用。每種抑制褐變發(fā)生的方法都有一定的適用范圍和局限性,應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)中的實(shí)際情況選擇不同的方法,使其有效地抑制或減輕組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生。

3.6 選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件

培養(yǎng)過程中還要注意適宜的培養(yǎng)條件。因?yàn)樵诜宇愇镔|(zhì)的合成和氧化過程中，有許多酶系統(tǒng)參與，其中部分酶系統(tǒng)是光活性的。燕麥花藥組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)在黑暗中和再生在昏暗的弱光下[14]，以減少褐化。較高的溫度會(huì)使酶促褐變加強(qiáng)，所以建議在培養(yǎng)過程中保持較低的溫度來減輕培養(yǎng)材料的褐變。Ponitka A等[17]把燕麥花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基后再生溫度調(diào)整為22℃，降低了褐化并且獲得綠苗最高能達(dá)到42.2%。Sidlu和Davies[33]報(bào)道了使用高pH（8.0）的培養(yǎng)基比pH（5.8）較低的培養(yǎng)基能誘導(dǎo)出更多的愈傷組織，在培養(yǎng)基的pH為8.0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制，愈傷組織容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。燕麥花藥培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的pH要控制在一定的范圍內(nèi)，不要太高，也不要太低，建議最佳pH為5.8。

3.7 其他建議

在取穗時(shí)，選擇在晴天的上午 7：00～9：00，這個(gè)時(shí)期小孢子活力強(qiáng)，可以預(yù)防出現(xiàn)褐化；培養(yǎng)密度30個(gè)/皿（直徑 3.5 cm）[25]，如果密度過高隨著營(yíng)養(yǎng)元素、激素的消耗及分泌物的積累導(dǎo)致表細(xì)胞生理品性降低容易產(chǎn)生褐化；不斷添加新鮮的培養(yǎng)液以減輕褐化現(xiàn)象；適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)皿（瓶）周期，如接種2 d轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，就可以減少酚類物質(zhì)積累，連續(xù)轉(zhuǎn)移幾次可以有效的防止褐化；發(fā)現(xiàn)愈傷組織有褐變現(xiàn)象要及時(shí)繼代，選擇合適的繼代時(shí)間，一般15 d進(jìn)行1次繼代，將未發(fā)生褐變的愈傷組織轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中，挑出褐變的愈傷組織，在轉(zhuǎn)皿（瓶）過程中做到輕拿輕放，盡量避免損傷愈傷組織，因?yàn)槿藶閾p傷也會(huì)增加愈傷組織的褐變；如果有愈傷組織逐漸呈現(xiàn)水浸狀和半透明狀，可以在繼代培養(yǎng)基中適當(dāng)加入甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓，避免褐變死亡；在轉(zhuǎn)移時(shí)選擇表面粗糙、凹凸不平、硬度適中的愈傷組織可以避免愈傷組織轉(zhuǎn)移后發(fā)生褐化。

4 討論及展望

褐變可導(dǎo)致燕麥花藥、愈傷組織和幼苗死亡。褐變的發(fā)生過程比較復(fù)雜，不同基因型和不同生理狀態(tài)下燕麥體內(nèi)的酚類物質(zhì)、酶及其他化合物等因素可引起燕麥組織褐變，培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分和含量、糖的來源和濃度、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比及其他附加物質(zhì)的添加，培養(yǎng)時(shí)的光照時(shí)間和強(qiáng)度、溫度的不同、二氧化碳和pH等外界培養(yǎng)條件均可引起燕麥組織褐變。雖然褐變過程復(fù)雜，但經(jīng)過多年的研究和發(fā)展，一部分褐變規(guī)律和機(jī)理已被掌握，同時(shí)也提出了一些有效減輕和防止組織褐變的方法。但是還需要不斷從組織組成、超微結(jié)構(gòu)學(xué)、染色體片段等方面深入研究褐化機(jī)制，找到影響褐變的主導(dǎo)因子和克服褐變的更有效方法，并從實(shí)踐上防止褐變的發(fā)生。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，今后應(yīng)在相關(guān)致褐基因的表達(dá)上解釋褐變機(jī)制，加強(qiáng)防止燕麥愈傷組織褐變措施的研究。抑制燕麥花藥組織培養(yǎng)發(fā)生褐變的措施多種多樣，但每種方法都有一定的適用范圍和局限性，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)中的實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǎ蛊溆行У匾种苹驕p輕燕麥花藥組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生。