雌激素在大豆體內(nèi)富集特點(diǎn)研究

張春玉，姜福佳，劉 東，李 季，于麗靜，耿 敏

(1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130507)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量有機(jī)化合物和工業(yè)“三廢”等有毒、有害污染物排放到環(huán)境中，特別隨著動(dòng)物避孕藥等畜牧業(yè)用藥在飼料中使用頻率的增加，含有過(guò)量雌激素的動(dòng)物糞便和尿液不斷排放到土壤和水體.由于雌激素具有生物蓄積時(shí)間長(zhǎng)、自然條件下難降解的特點(diǎn)，因此雌激素污染問(wèn)題隨之而來(lái)，雌激素污染帶來(lái)的食品安全問(wèn)題也逐步引起人們的關(guān)注[1-3].雌激素屬于內(nèi)分泌干擾物，不易被降解，它能?chē)?yán)重干擾人類(lèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的形成及代謝等過(guò)程，危害人類(lèi)健康[4-6].大量雌激素污染物通過(guò)吸附—解吸、遷移、轉(zhuǎn)化等途徑在土壤和水體中富集[7-9]，再經(jīng)過(guò)動(dòng)、植物食物鏈進(jìn)行人體，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重大問(wèn)題[10].雌二醇(Estradiol，E2)是活性最高、干擾作用最大的環(huán)境雌激素[3]；而乙炔雌二醇(Ethinylestradiol，EE2)是一種人工合成的雌激素，其在雌激素類(lèi)污染物中具有十倍的毒性效力[11].研究[12]表明，雌激素進(jìn)入環(huán)境后并不會(huì)產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)，未見(jiàn)有植物根部出現(xiàn)中毒、植株枯萎死亡和產(chǎn)量降低等的研究報(bào)道；然而雌激素可由被污染的土壤中進(jìn)入植物體內(nèi)并進(jìn)行富集[13-14]，人類(lèi)可能通過(guò)食用這些受污染的植物而受到危害，造成嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題.

為了證實(shí)雌激素對(duì)農(nóng)作物，特別是對(duì)重要的糧食作物和油料作物——大豆是否存在生長(zhǎng)抑制或體內(nèi)富集等潛在危害，本文以E2和EE2為主要研究對(duì)象，通過(guò)水培大豆實(shí)驗(yàn)，研究了雌激素對(duì)大豆萌發(fā)過(guò)程中下胚軸生長(zhǎng)的影響，并分析了大豆的根、莖葉、果實(shí)對(duì)E2和EE2的吸收、富集特點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

E2和EE2購(gòu)自Sigma-aldrich(西格瑪奧德里奇，上海)貿(mào)易有限公司；提取溶劑使用分析純氯仿(北京化工)；色譜純乙腈購(gòu)于Themo Fisher Scientific(賽默飛巴爾科技)公司；超純水(Ultrapure water，18.2 MΩcm-1) ，用于高效液相色譜(HPLC)分析.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(杭州萬(wàn)特衡器有限公司)，離心機(jī)(Avanti JXN-26，BECKMAN COULTER和Centrifuge 5430 R，Eppendorf)，真空干燥機(jī)BZF-30，高效液相色譜(HPLC)儀(Waters e2695)，檢測(cè)器為UV(2988 Waters Detector)，色譜柱為C18柱(粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm)，氣相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜儀(Agilent 7890A/5975C).

1.3 大豆處理實(shí)驗(yàn)

1.3.1 豆芽的培養(yǎng)與雌激素處理

取適量健康的大豆(和平1號(hào))置于潔凈托盤(pán)中，加入少量雙蒸水，用紗布覆蓋保持潮濕，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，期間每天更換3次水.待大豆發(fā)出芽體，選取大小一致的豆芽30株，用浮漂將豆芽固定，向豆芽根部加入雙蒸水并沒(méi)過(guò)根部，避免將豆芽全部浸泡.隨機(jī)將30株大豆芽分為5組，即E2濃度分別為0(對(duì)照組)及0.002，0.01，0.02，0.05 mmol/L處理組，每組6株豆芽.上述豆芽室溫條件下連續(xù)處理5 d.

1.3.2 大豆植株的雌激素處理

于6月下旬，從大田中選取整株長(zhǎng)勢(shì)一致、剛剛長(zhǎng)出細(xì)小豆莢的大豆植株(和平1號(hào))，根部用水洗滌并將大豆植株移栽于水培箱中，用Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液緩苗培養(yǎng)3 d.選擇生長(zhǎng)一致的大豆植株24株，隨機(jī)分為6組，分別是對(duì)照組(不添加E2和EE2)；E2組(E2濃度分別為0.002，0.01，0.02，0.05 mmol/L)；EE2組(EE2濃度為0.05 mmol/L)，每組大豆植株4株.每天更換處理液，定時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，處理期間注意避雨.連續(xù)處理10 d后收取大豆材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.4 大豆樣品雌激素提取

制備豆芽樣品[15]：從處理液中取出萌發(fā)5 d的豆芽，用雙蒸水進(jìn)行充分清洗，測(cè)量豆芽長(zhǎng)度并提取雌激素.雌激素提取方法為：用研磨器將整棵豆芽充分研磨混勻，稱(chēng)取1 g樣品放入10 mL 離心管中，加入1 mL ddH2O混勻；再加入1 mL氯仿，搖床振搖20 min，4 000 r/min離心10 min；吸取下相(氯仿相)500 μL，13 000 r/min離心10 min；再取下相300 μL進(jìn)行真空干燥，4℃冰箱保存、待測(cè).

制備大豆植株樣品：將整棵大豆植株用雙蒸水充分清洗，去除表面雜質(zhì)后，用濾紙干燥.分別剪取豆莢、莖葉和根部，進(jìn)行雌激素提取，方法同上.

1.5 雌激素HPLC檢測(cè)

利用HPLC(Waters e2695) 檢測(cè)雌激素.檢測(cè)器為UV(2988 Waters Detector).色譜柱為C18柱(粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm，Waters).液相色譜分離條件為：以V(乙腈)∶V(水)= 50 ∶ 50作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，λ=225 nm，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為27℃.每個(gè)實(shí)驗(yàn)、對(duì)照均重復(fù)4次.

2 結(jié)果與分析

2.1 E2和EE2的HPLC檢測(cè)

利用高效液相色譜儀對(duì)0.1 mmol/L E2和 EE2的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析和檢測(cè)，HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可見(jiàn)，E2和EE2分別在4.1 min和5.1 min出現(xiàn)了兩個(gè)色譜峰，峰型尖銳對(duì)稱(chēng)、無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明建立了E2和 EE2的良好檢測(cè)條件.

圖1 0.1 mmol/L E2和EE2標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

2.2 E2對(duì)豆芽下胚軸生長(zhǎng)的影響

不同濃度E2處理下，培養(yǎng)5 d后豆芽的生長(zhǎng)變化情況如圖2a所示.對(duì)照組經(jīng)過(guò)5 d的培養(yǎng)，豆芽下胚軸的長(zhǎng)度由最初的平均3.5 cm伸長(zhǎng)到17.8 cm，并生長(zhǎng)出10余根根毛，根毛較長(zhǎng)；E2處理下，大豆下胚軸的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，同時(shí)根毛的數(shù)量也發(fā)生了顯著的變化.

0.002 mmol/L E2處理下，豆芽下胚軸的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到了輕微的抑制，與對(duì)照相比，下胚軸長(zhǎng)度降低了9.0%；根毛的數(shù)量也有所減少且根毛的長(zhǎng)度縮短.0.01 mmol/L和0.02 mmol/L E2的處理下，豆芽下胚軸的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)進(jìn)一步受到抑制，平均長(zhǎng)度為14.1 mm和12.6 mm，與對(duì)照相比，下胚軸長(zhǎng)度降低了20.8%和29.2%；根部的根毛僅長(zhǎng)出1～4根，長(zhǎng)度極短.隨著E2濃度的進(jìn)一步增加，0.05 mmol/L E2處理下，豆芽下胚軸的伸長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，長(zhǎng)度僅為9.8mm，生長(zhǎng)速度下降了 44.9%；根部未見(jiàn)根毛生成.E2處理濃度的升高不僅加劇了對(duì)豆芽下胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的抑制，而且對(duì)根毛的產(chǎn)生和伸長(zhǎng)長(zhǎng)度也出現(xiàn)了顯著的抑制(見(jiàn)圖2b).

a不同濃度E2處理下豆芽下胚軸的變化；b不同濃度E2處理對(duì)豆芽下胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響

2.3 大豆芽中E2含量分析

利用HPLC檢測(cè)大豆芽在不同濃度E2處理下E2含量變化的情況，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)，低濃度E2(0.002 mmol/L)處理下，大豆幼苗中在4.1 min處沒(méi)有吸收峰出現(xiàn)；當(dāng)E2濃度≥0.01 mmol/L時(shí)，隨著E2濃度的升高，大豆芽對(duì)E2的富集隨之增加，說(shuō)明高濃度的E2會(huì)造成豆芽體內(nèi)E2的富集，這可能也是造成大豆芽下胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受阻的主要原因.

圖3 不同濃度E2處理下大豆幼苗中E2含量的HPLC

2.4 大豆根系中E2含量分析

不同E2處理下大豆根部E2含量的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，不同濃度E2處理的大豆根部在4.1 min均出現(xiàn)肩峰，肩峰數(shù)值較低.根據(jù)植物根系對(duì)有機(jī)物吸收的特點(diǎn)，推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于根部對(duì)E2僅僅是吸附作用而不是富集作用.

圖4 不同濃度E2處理下大豆根系中E2含量的HPLC

2.5 大豆果實(shí)中E2含量分析

對(duì)不同濃度E2處理液中生長(zhǎng)的大豆果實(shí)進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖5可見(jiàn)，在不同濃度E2的培養(yǎng)環(huán)境中，所有參與檢測(cè)的大豆果實(shí)中均可檢測(cè)到E2，而且果實(shí)中E2的含量隨著處理液中E2濃度的升高而增加.這一結(jié)果說(shuō)明E2能夠在大豆果實(shí)中進(jìn)行富集，并隨著環(huán)境中E2濃度的升高，富集程度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系.這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于大豆果實(shí)中油脂含量較高，而雌激素為脂溶性物質(zhì)，因此能夠在大豆果實(shí)中富集.

圖5 不同濃度E2處理下大豆果實(shí)中E2含量的HPLC

2.6 大豆莖葉中E2含量分析

大豆莖葉中E2含量的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6可見(jiàn)，莖葉樣品在4.1 min處未發(fā)現(xiàn)E2的吸收峰，說(shuō)明E2不能在大豆的莖葉中富集.

圖6 不同濃度E2處理下大豆莖葉中E2含量的HPLC

2.7 大豆根部EE2含量分析

大豆根部EE2富集情況的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7.由圖7可見(jiàn)，濃度為0.05 mmol/L的EE2處理10 d后，與對(duì)照組相比，大豆根部在5.1 min處出現(xiàn)一個(gè)小吸收峰，表明EE2在大豆根部有一定程度的積累.

圖7 不同濃度EE2處理下大豆根系中EE2含量的HPLC

2.8 大豆果實(shí)中EE2含量分析

大豆果實(shí)中EE2富集情況的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8.由圖8可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)0.05 mmol/L濃度的EE2培養(yǎng)后，相對(duì)于對(duì)照組大豆果實(shí)在5.1 min處出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，說(shuō)明在該濃度條件下，EE2可在大豆果實(shí)中富集.

圖8 不同濃度EE2處理下大豆果實(shí)中EE2含量的HPLC

2.9 EE2在大豆莖葉中的富集情況

大豆莖葉中EE2富集情況的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9.由圖9可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)濃度為0.05 mmol/L的EE2培養(yǎng)，與對(duì)照組相比，處理組的大豆莖葉在5.1 min處并沒(méi)有吸收峰出現(xiàn)，表明EE2在大豆莖葉中不能富集.

圖9 不同濃度EE2處理下大豆莖葉中EE2含量的HPLC

3 討論

3.1 E2對(duì)大豆萌發(fā)具有抑制作用

本文的研究結(jié)果表明，大豆在萌發(fā)過(guò)程中隨著E2處理濃度由0.002 mmol/L逐步升高到0.05 mmol/L，對(duì)大豆生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì).無(wú)論是低濃度的E2還是高濃度的E2均對(duì)大豆下胚軸的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)起到了抑制作用，且隨著E2處理濃度的升高，下胚軸生長(zhǎng)受到的抑制作用越強(qiáng)；同時(shí)根毛的數(shù)量和長(zhǎng)度也隨E2處理濃度的升高而減少，0.05 mmol/L E2處理時(shí)，沒(méi)有根毛生長(zhǎng).HPLC分析結(jié)果表明，大豆芽對(duì)E2的富集隨著處理液濃度的升高而增加，E2在大豆芽的富集是抑制大豆萌發(fā)過(guò)程中下胚軸延伸和根毛生成的主要原因.

3.2 雌激素在大豆體內(nèi)的富集特點(diǎn)

本文的研究結(jié)果表明，E2和EE2在大豆植株各部分的富集作用存在差異.大豆根系僅在高濃度(0.05 mmol/L)雌激素作用下才能檢測(cè)出來(lái)，且含量較低，說(shuō)明根系對(duì)雌激素具有吸附和吸收的特點(diǎn)，并不在根系中富集.對(duì)于大豆果實(shí)而言，無(wú)論是E2還是EE2在果實(shí)中的含量均隨外界雌激素的增加而增加，說(shuō)明果實(shí)是雌激素積累的主要部位.在各濃度E2和EE2對(duì)大豆莖葉的處理下，通過(guò)HPLC法在莖葉中均未檢測(cè)出雌激素的存在，表明E2和EE2不能在大豆的莖葉中富集，莖葉只是起到了運(yùn)輸?shù)淖饔?由于大豆的可食用部分主要是果實(shí)，因此果實(shí)中E2和EE2的富集現(xiàn)象表明，環(huán)境中的雌激素會(huì)產(chǎn)生食品安全風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)人類(lèi)健康造成危害.

4 結(jié)論

通過(guò)本文研究可以證實(shí)：E2對(duì)大豆下胚軸的延伸和根系形成具有抑制作用，且抑制作用隨E2處理濃度的升高而增強(qiáng).E2和EE2在大豆根、莖葉和果實(shí)的富集特點(diǎn)不同，主要富集在大豆果實(shí)中，這說(shuō)明環(huán)境中的雌激素可以通過(guò)大豆進(jìn)入食物鏈，從而對(duì)人體健康造成潛在的威脅，環(huán)境中雌激素的危害應(yīng)該受到廣泛的關(guān)注.