劉一凡,阿力木江·加帕爾,葉爾保勒,祖力亞·克力木江,韋麗婷,翟雪潔,巴音查汗·蓋力克,王振寶*
(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.伊寧海關(guān),新疆伊寧 835000)
蜱屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropod)、蛛形綱(Arachnida)、蜱螨目(Acarina)、蜱亞目(Ixodides)、硬蜱科(Ixodidea),是廣泛寄生于哺乳動(dòng)物、爬行類、鳥(niǎo)類和兩棲類等脊椎動(dòng)物(魚(yú)類除外)體表的節(jié)肢動(dòng)物[1]。蜱蟲(chóng)作為一種專性吸血的體外寄生動(dòng)物,是僅次于蚊子的第二大蟲(chóng)媒介生物[2],在全球范圍對(duì)人畜健康造成很大危害[3]。蜱蟲(chóng)在叮咬宿主動(dòng)物的同時(shí)釋放出毒素,儲(chǔ)存和傳播多種嚴(yán)重的自然疫源性疾病及人獸共患病的病原[4-5],如立克次體、無(wú)形體、犬埃立克體、貝氏柯克斯體、萊姆病螺旋體、巴貝斯蟲(chóng)、泰勒焦蟲(chóng)等[6-7]。我國(guó)常見(jiàn)寄生于犬體表的蜱有血紅扇頭蜱[8]、微小牛蜱[9]、鐮形扇頭蜱、長(zhǎng)角血蜱[10]、鈴頭血蜱和草原血蜱[11-12],其中以血紅扇頭蜱為優(yōu)勢(shì)蜱種,這說(shuō)明犬是多種蜱種的宿主,這些蜱蟲(chóng)常在雨后潮濕悶熱的環(huán)境中在草地、灌木叢穿行的犬體表大量出現(xiàn)。據(jù)報(bào)道表明,圖蘭扇頭蜱為新疆的優(yōu)勢(shì)蜱種[13]常寄生于羊、牛、馬等家畜[14],主要分布在新疆的喀什、和田、輪臺(tái)、沙雅、霍城、哈密、庫(kù)爾勒、阿拉山口等荒漠草原和荒漠地區(qū)[15-16]。2015年在新疆伊寧縣現(xiàn)發(fā)現(xiàn)圖蘭扇頭蜱,這可能與新疆北疆地區(qū)近30年雨水量過(guò)少、特殊的植被分布及氣候變化有關(guān)[17]。
對(duì)于烏魯木齊市犬體表蜱蟲(chóng)寄生率及其種群分布特點(diǎn)、蜱蟲(chóng)種類、以及蜱媒傳染病,尤其是新發(fā)蜱媒傳染病的疾病尚不清楚。因此,本試驗(yàn)選取犬體表寄生蜱蟲(chóng)種類作為研究對(duì)象,對(duì)烏魯木齊市犬體表的蜱蟲(chóng)寄生的主要蜱蟲(chóng)寄生率及其種類進(jìn)行了初步調(diào)查和鑒定,旨在為進(jìn)一步研究烏魯木齊市蜱傳病原體帶來(lái)的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題提供理論數(shù)據(jù)參考。
1.1.1 蜱蟲(chóng)采集 2020年3月至6月在烏魯木齊市多家動(dòng)物醫(yī)院、寵物店、犬舍、流浪狗基地、社區(qū)隨機(jī)選取無(wú)明顯發(fā)病癥狀的犬只作為調(diào)查對(duì)象。采取宿主體表檢查法[3]對(duì)犬頭部、頸部、胸腹部、背部、四肢、腋下、腹股溝、尾部等部位進(jìn)行檢查。經(jīng)檢查獲得的蜱蟲(chóng),使用止血鉗夾緊蜱蟲(chóng)頭部對(duì)其進(jìn)行采集。將采集到的蜱蟲(chóng)逐一編號(hào)并記錄宿主信息置于恒溫恒濕的陰暗環(huán)境中,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
1.1.2 主要試劑 2 × EcoTaqPCR SuperMix,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;DNA Marker DL 1000,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;TIANGEN基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司產(chǎn)品。
1.1.3 主要儀器 LEICA M205 FA徠卡體視顯微鏡多重聚焦系統(tǒng),德國(guó)徠卡儀器(中國(guó))有限公司產(chǎn)品;RETSCH MM400混合冷凍混合球磨儀,費(fèi)爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;AllegraTM X-22R Centrifuge多功能冷凍臺(tái)式離心機(jī),貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司產(chǎn)品;Biometre TProfessional TRIO 48三槽高速熱循環(huán)儀,上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 用蒸餾水將采集到的蜱蟲(chóng)反復(fù)沖洗3次后置于700 mL/L乙醇中保存?zhèn)溆?。參照《新疆蜱類志》[14],利用普通體視顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步觀察,再利用LEICA M205 FA徠卡體視顯微鏡多重聚焦系統(tǒng)進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析及蜱種鑒定,對(duì)蜱蟲(chóng)的假頭基、盾板、氣門板、生殖孔、肛側(cè)板、肛溝、基節(jié)等具有形態(tài)學(xué)鑒定意義的部位進(jìn)行觀察對(duì)比并拍攝圖片。
1.2.2 蜱蟲(chóng)DNA提取 從上述形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果中隨機(jī)挑選不同蜱蟲(chóng)種類的蜱蟲(chóng)各4只,依次用乙醇濃度為700、500、300、100 mL/L的乙醇溶液在恒溫培養(yǎng)搖床中搖床沖洗1 h,再使用高壓蒸汽滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗,經(jīng)干燥冷凍后利用RETSCH MM400混合冷凍混合球磨儀,將蜱蟲(chóng)磨碎,利用CTAB法提取蜱基因組DNA,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 蜱蟲(chóng) 16S rDNA基因擴(kuò)增 參照蜱蟲(chóng)線粒體16S rDNA基因特異性引物[15],上游引物:5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′,下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′,目的片段大小為460 bp,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL:2 × EcoTaqPCR SuperMix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,補(bǔ)dd H2O至25 μL,混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min;92℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)35次;72℃ 8 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,分別向PCR產(chǎn)物中加入3 μL 6×Loading buffer,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,使用G:BOX EF凝膠成像分析儀觀察試驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。
1.2.4 遺傳進(jìn)化分析 委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物(460 bp)進(jìn)行正向測(cè)序。將所測(cè)得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索,應(yīng)用序列分析軟件DNAstar進(jìn)行同源性對(duì)比分析,應(yīng)用MEGA7軟件,采用鄰接算法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。
本試驗(yàn)共調(diào)查烏魯木齊市1 054只犬,在240只犬體表帶蜱,共采集到蜱蟲(chóng)889只,通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法,共獲得1科1屬2種蜱,分別是扇頭蜱屬Rhipicephalus的血紅扇頭蜱(R.sanguineus)和圖蘭扇頭蜱(R.turanicus)(表1)。
表1 烏魯木齊犬體表蜱蟲(chóng)種類及組成Table 1 Species and composition of ticks on the surface of dogs in Urumqi
2.1.1 血紅扇頭蜱
(1)雄蜱:蟲(chóng)體長(zhǎng)約1.9 mm~3.8 mm,呈紅褐色卵圓形;假頭基呈六角形,寬稍大于長(zhǎng),側(cè)角發(fā)達(dá),基突明顯呈小尖齒狀,后緣微凹向上呈半弧形,須肢寬粗短;盾板呈長(zhǎng)卵形,前端較窄后端寬鈍,分布有粗細(xì)不等的刻點(diǎn),肩突鈍圓,眼不明顯,頸溝深而短,側(cè)溝深而細(xì)長(zhǎng),自眼后起與第1緣垛相連(圖1A);肛側(cè)板上段直細(xì)窄,下段后緣呈圓弧形,后緣較寬無(wú)齒突;緣垛明顯,中垛常大于旁邊緣垛,部分蟲(chóng)體有尾突;基節(jié)Ⅰ外距常略短于內(nèi)距,長(zhǎng)而直;基節(jié)Ⅱ~Ⅳ各有一外距呈短齒狀按節(jié)序依次漸?。换?jié)Ⅱ、Ⅲ后內(nèi)角較窄鈍;基節(jié)Ⅳ后內(nèi)角側(cè)有一短突(圖1B);氣門扳長(zhǎng)逗點(diǎn)形,基部較寬圓,背突逐漸變窄直達(dá)盾板背緣(圖1C);除跗節(jié)Ⅰ外,跗節(jié)Ⅱ~Ⅳ腹緣末端和亞末端均有小齒(圖1D)。
(2)雌蜱:蟲(chóng)體長(zhǎng)約2.0 mm~3.8 mm,呈卵圓形;假頭基呈六角形,寬大稍于長(zhǎng),側(cè)角發(fā)達(dá),基突寬鈍后緣較平直,孔區(qū)小,卵圓形,須肢粗短;盾扳長(zhǎng)略勝于寬,呈紅褐色,后側(cè)緣似微波紋,眼大呈卵圓形突出,于盾扳最寬處;頸溝前端深向后呈八字分開(kāi),約到盾板中后部,側(cè)溝深長(zhǎng)達(dá)盾板后側(cè);(圖1E);基節(jié)Ⅰ外距長(zhǎng)而直短于內(nèi)距;基節(jié)Ⅱ~Ⅳ外距短鈍,依次減??;基節(jié)Ⅱ、Ⅲ后內(nèi)角窄鈍,基節(jié)Ⅳ內(nèi)角有一短突(圖1F);跗節(jié)Ⅱ~Ⅳ腹緣末端和亞末端有小齒。氣門扳呈逗點(diǎn)形長(zhǎng)大于寬,背突短后緣略凸出(圖1G);跗節(jié)Ⅰ無(wú);爪墊較小,近達(dá)爪長(zhǎng)之半(圖1H)。
2.1.2 圖蘭扇頭蜱
(1)雄蜱:蟲(chóng)體長(zhǎng)約1.9 mm~3.5 mm,呈卵圓形褐色,盾板卵圓形,前部較窄,后部圓鈍,兩側(cè)稍突出,表面遍布較多細(xì)刻點(diǎn);頸溝短而深陷,眼橢圓形靠側(cè)緣;側(cè)溝窄長(zhǎng)明顯,自眼后延伸至第2個(gè)緣垛(圖2A);須肢粗短;假頭基六角形,寬稍大于長(zhǎng),測(cè)角圓突,后緣向上微凹;基突較寬大(圖2C);基節(jié)Ⅰ外距比內(nèi)距稍長(zhǎng)或相等;基節(jié)Ⅱ~Ⅳ外距較小,呈齒狀逐漸變??;基節(jié)Ⅱ內(nèi)距呈脊?fàn)?,基?jié)Ⅲ無(wú)內(nèi)距,基節(jié)Ⅳ有明顯的小齒狀內(nèi)距;肛側(cè)板窄長(zhǎng),外緣近于垂直,下段明顯向內(nèi)傾斜,內(nèi)緣中下部有淺凹,下方有一明顯齒突;副肛側(cè)板短小,呈錐狀,中垛大于邊垛,有尾突顏色較淺(圖2B);氣門扳近長(zhǎng)橢圓形,背突寬短,且急劇彎曲,末端呈截形或圓鈍(圖2D)。
(2)雌蜱:蟲(chóng)體長(zhǎng)約2.0 mm~3.5 mm,呈卵圓形,盾板長(zhǎng)勝于寬,近卵圓形,后側(cè)緣微波狀,戶端圓鈍凸出,呈赤褐色帶亮光,眼大呈橢圓形,略微凸起(圖2E);假頭基寬短,側(cè)角明顯鈍凸,基突短鈍,后緣較平直(圖2G);基節(jié)Ⅰ外距比內(nèi)距長(zhǎng)偶爾相等,基節(jié)Ⅱ~Ⅳ各具齒狀外距逐漸減?。粌?nèi)距皆無(wú)(圖2F);氣門扳近逗點(diǎn)形,長(zhǎng)稍微大于寬,背突粗短,末端圓鈍(圖2H)。
A.背面觀♂(15×);B.腹面觀♂(15×);C.氣門扳♂(90×);D.跗節(jié)Ⅳ♂(70×);E.背面觀♀(18×);F.腹面觀♀(55×);G.氣門扳♀(129×);H.跗節(jié)Ⅳ♀(60×)A.Dorsal view♂(15×);B.Ventral view♂(15×);C.Peritreme♂(90×);D.Tarsus Ⅳ♂(70×);E.Dorsal view♀(18×);F.Ventral view♀(55×);G.Peritreme♀(129×);H.Tarsus Ⅳ♀(60×)圖1 血紅扇頭蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.1 Morphological identification of R.sanguineus
A.背面觀♂(16×);B.腹面觀♂(16×);C.假頭基背面♂(85×);D.氣門扳♂(95×);E.背面觀♀(15×);F.腹面觀♀(15×);G.假頭基背面♀(70×);H.氣門扳♀(100×)A.Dorsal view♂(16×);B.Ventral view♂(16×);C.Capitulum dorsal♂(85×);D.Peritreme♂(95×);E.Dorsal view♀(16×);F.Ventral view♀(16×);G.Capitulum dorsal♀(70×);H.Peritreme♀(100×)圖2 圖蘭扇頭蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Morphological identification of R.turanicus
2.2.1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用PCR方法擴(kuò)增蜱蟲(chóng)線粒體16S rDNA特異性基因片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,在460 bp左右出現(xiàn)目的條帶,與目標(biāo)條帶大小相符(圖3)。
M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~4.檢測(cè)樣本;“-”陰性
2.2.2 遺傳進(jìn)化分析 將所得PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析,結(jié)果表明,所采集的蜱蟲(chóng)分別為血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱。用MEGA7軟件對(duì)經(jīng)Blast比對(duì)得到的數(shù)據(jù)庫(kù)中的血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),發(fā)現(xiàn)本地區(qū)采集的4條血紅扇頭蜱16S rDNA序列獨(dú)立的形成一個(gè)分支;本地采集的圖蘭扇頭蜱與已知的新疆的圖蘭扇頭蜱在一個(gè)分支上,具有很高的同源性(圖4)。
圖4 基于16S rDNA基因的蜱系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of ticks based on 16S rDNA genes
本試驗(yàn)于2020年3至6月對(duì)烏魯木齊市共1 054只犬感染蜱蟲(chóng)的情況進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)在240只犬的體表有蜱蟲(chóng)寄生。共采集到889只蜱。在蜱蟲(chóng)樣本收集過(guò)程中發(fā)現(xiàn),從3月底開(kāi)始少部分犬體表出現(xiàn)少量蜱蟲(chóng),4月中旬大量暴發(fā)一直持續(xù)至6月初開(kāi)始慢慢減少,6月中旬大量減少,6月底極少。這與已發(fā)表的文獻(xiàn)[15,18]新疆地區(qū)采集蜱蟲(chóng)時(shí)間及活動(dòng)高峰相似。
形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),鑒定要點(diǎn)為血紅扇頭蜱跗節(jié)Ⅱ~Ⅳ腹緣末端和亞末端均有小齒,肛側(cè)板后緣呈圓弧形較寬無(wú)齒突;圖蘭扇頭蜱有一顏色稍淺于盾板的尾突,肛側(cè)板內(nèi)緣淺凹處有一明顯齒突,部分血紅扇頭蜱與圖蘭扇頭蜱形態(tài)相似。所以對(duì)蜱種準(zhǔn)確的鑒定不能單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法,應(yīng)該結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)同種蜱類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。本試驗(yàn)在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,結(jié)合蜱類線粒體16S rDNA對(duì)蜱進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明新疆烏魯木齊市犬體表主要寄生的蜱蟲(chóng)種類主要為血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱,遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)新疆烏魯木齊市的血紅扇頭蜱與中國(guó)境內(nèi)河北地區(qū)的血紅扇頭蜱具有較高的同源性,序列P115與P112、P23、P104處于不同的遺傳進(jìn)化分支;圖蘭扇頭蜱與中國(guó)境內(nèi)河北地區(qū)與新疆的圖蘭扇頭蜱均有較高的同源性,P118與P7、P114、P116處于不同的遺傳進(jìn)化分支,均與國(guó)外報(bào)道的蜱蟲(chóng)16S rDNA基因有較大的差異,說(shuō)明血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱均具有遺傳進(jìn)化的保守性。此次發(fā)現(xiàn)的烏魯木齊市犬體表寄生的血紅扇頭蜱及圖蘭扇頭蜱優(yōu)勢(shì)度相當(dāng),由于蜱傳播病原體一般與蜱種之間存在著一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,親緣關(guān)系越近的蜱種,其傳播相同病原體的機(jī)會(huì)越大,已知血紅扇頭蜱為犬巴貝斯蟲(chóng)的傳播媒介[14],此發(fā)現(xiàn)有待于今后對(duì)烏魯木齊及周邊地區(qū)犬蜱、蜱傳犬巴貝斯蟲(chóng)病及蜱傳人畜共患疾病進(jìn)一步深入研究。