寧夏吳忠地區(qū)奶牛臨床型乳房炎主要病原菌的分離鑒定及耐藥性分析

宋 倩，達(dá)舉云，李怡娜，史金蓮，李宗帥，趙興緒，張 勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070)

奶牛乳房炎(Cow mastitis)由多種因素引起，如環(huán)境因素、擠奶方式及飼養(yǎng)管理等，其防治比較困難[1-2]。真菌、細(xì)菌、支原體和病毒都可引起乳房炎的發(fā)生，根據(jù)病原的來(lái)源和傳播途徑，可將其分為環(huán)境性病原和接觸傳染性病原兩大類[3-4]。生產(chǎn)實(shí)際中多種病原菌混合感染引發(fā)的乳房炎比較常見(jiàn)[5]。臨床型乳房炎奶牛主要表現(xiàn)為乳房腫脹，食欲減退，體溫升高，乳汁稀薄并伴有絮狀物，嚴(yán)重時(shí)乳汁中會(huì)伴隨血液，乳房觸摸時(shí)質(zhì)地堅(jiān)硬[6]?；疾∧膛５娜橹焚|(zhì)下降，嚴(yán)重降低了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)于罹患乳房炎的奶牛治療主要以抗菌藥物為主[7]，亂用或者濫用抗生素進(jìn)行治療會(huì)使乳汁中殘留抗生素，危害人類健康[8]。本試驗(yàn)主要以寧夏吳忠地區(qū)的臨床型乳房炎為研究對(duì)象，從吳忠地區(qū)3個(gè)大型奶牛場(chǎng)采集乳樣，進(jìn)行病原菌的分離、革蘭氏染色、生化鑒定、16S rRNA序列分析、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因檢測(cè)，分析病原菌的耐藥情況，為該地區(qū)奶牛乳房炎的治療和預(yù)防用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集寧夏吳忠地區(qū)臨床型乳房炎乳樣56份作為細(xì)菌分離的病料。

1.1.2 主要試劑 無(wú)菌脫纖維綿羊血，南京森貝伽生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯，瓊脂粉，MHB培養(yǎng)基，革蘭氏染液，北京索萊寶科技有限公司；藥敏試紙，細(xì)菌微量生化鑒定管，杭州濱和微生物試劑有限公司；山羊血清，天津康源生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；生物安全柜，蘇州賽默飛世爾科技有限公司；Eppendorf離心機(jī)，北京艾本德中國(guó)有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；生物顯微鏡，英菲洛精密科技(蘇州)有限公司；PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 根據(jù)蘭州乳房炎檢測(cè)法及動(dòng)物臨床癥狀(具有乳腺組織出現(xiàn)腫脹、體溫升高、乳汁稀薄并伴有絮狀物或血液等)，從寧夏吳忠地區(qū)的3個(gè)奶牛場(chǎng)分別采集乳房炎患病奶牛乳樣共計(jì)56份。采集乳樣時(shí)，對(duì)乳區(qū)進(jìn)行碘伏擦拭消毒，丟棄前3把乳樣后進(jìn)行采集。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌條件下，將混勻的乳樣接種至50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。挑取典型的單菌落編號(hào)：革蘭氏陰性桿菌的編號(hào)為W1，W2，W3，…共13株；革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌的編號(hào)為WZ1，WZ2，WZ3，…共8株。

1.2.3 細(xì)菌的生化鑒定 生化試驗(yàn)按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行，對(duì)分離出的革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行蔗糖試驗(yàn)、乳糖試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)；對(duì)分離出的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌進(jìn)行蔗糖試驗(yàn)、乳糖試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、馬尿酸鈉試驗(yàn)、七葉苷試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)。接種環(huán)移取少量純化培養(yǎng)物至細(xì)菌微量生化反應(yīng)管內(nèi)，在35℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)12 h,按照《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》的方法進(jìn)行觀察[9]。

1.2.4 16S rRNA鑒定 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)的提取步驟進(jìn)行DNA提取。以細(xì)菌16S rRNA通用引物為引物，序列為：F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 15 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。取7 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含10 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將條帶單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘭州天啟生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于NCBI官網(wǎng)上進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.2.5 構(gòu)建16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 在GenBank對(duì)16S rRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，并下載相似度較高的序列作為參考序列，使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用KB紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行復(fù)方新諾明、頭孢噻吩、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、青霉素G、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克拉霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、紅霉素等藥物的敏感性試驗(yàn)。

接種環(huán)蘸取純化的菌落后，使用無(wú)菌生理鹽水分別將其稀釋為0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木篬10]。取100 μL至MHB培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻，于37℃恒溫培養(yǎng)18 h。使用游標(biāo)卡尺對(duì)抑菌圈進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其敏感性。

1.2.7 耐藥基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[11-13] 合成sul1、sul2、aacC2、aacC4等15種耐藥基因引物，引物通過(guò)蘭州天啟生物科技有限公司進(jìn)行合成。擴(kuò)增體系為：上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master MIX 10 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 30 s,55℃～62℃ 30 s,72℃ 1 min,34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果經(jīng)鏡檢觀察，分離出革蘭氏陰性桿菌13株，染色特征為兩段鈍圓，中等大小，單個(gè)存在(圖1)；分離出革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌8株，染色特征為呈雙或者短鏈、長(zhǎng)鏈狀排列(圖2)。

圖1 革蘭氏陰性桿菌染色特征Fig.1 Gram-negative bacilli staining characteristics

圖2 革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌染色特征Fig.2 Gram-positive Streptococcus staining characteristics

2.2 生化鑒定結(jié)果

2.2.1 革蘭氏陰性桿菌生化鑒定結(jié)果 分離出的革蘭氏陰性桿菌乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(VP)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)以及硫化氫試驗(yàn)均呈陰性，吲哚試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，其中有3株不分解蔗糖，2株不分解乳糖，3株不分解甘露醇，3株甲基紅試驗(yàn)(MR)呈陰性。結(jié)果顯示，分離出的革蘭氏陰性桿菌菌株與大腸埃希氏菌具有相似的生化特性(表1)。

表1 革蘭氏陰性桿菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification results of Gram-negative bacilli

2.2.2 革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌生化鑒定結(jié)果 分離出的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌均可分解蔗糖和乳糖，不分解甘露醇，馬尿酸鈉與CAMP試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，七葉苷與觸酶試驗(yàn)呈陰性。結(jié)果顯示，分離出的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌菌株與無(wú)乳鏈球菌具有相似的生化特性(表2)。

表2 革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of Gram-positive Streptococcus

2.3 16S rRNA鑒定

2.3.1 革蘭氏陰性桿菌16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 分離出的革蘭氏陰性桿菌16S RNA擴(kuò)增長(zhǎng)度均在1 400 bp～1 500 bp(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～13:W1～W13M.DNA Marker DL 2 000;1-13:W1-W13圖3 分離的革蘭氏陰性桿菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 16S rRNA PCR amplification results of isolated Gram-negative bacillus strains

2.3.2 革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 分離出的13株革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌16S RNA擴(kuò)增長(zhǎng)度均在1 400 bp～1 500 bp(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色、生化鑒定、以及16S rRNA鑒定結(jié)果顯示，共分離出13株大腸埃希氏菌和8株無(wú)乳鏈球菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～13:WZ1～WZ8M.DNA Marker DL 2 000;1-13:WZ1-WZ8圖4 分離的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 16S rRNA PCR amplification results of isolation of Gram-positive Streptococcus strains

2.4 構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4.1 13株大腸埃希氏菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 針對(duì)于分離出的大腸埃希氏菌構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果分4個(gè)組別，其中W6獨(dú)自為一個(gè)分支，表明與其他菌株相比差異性較大。W11與剩下的相比，又為一個(gè)單獨(dú)的分支，W2、W4、W5、W7、W9為一個(gè)分支，W1、W3、W8、W10為一個(gè)分支，W12、W13分別在單獨(dú)的分支上(圖5)。

圖5 13株大腸埃希氏菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 The phylogenetic tree of 13 strains of Escherichia coli 16S rRNA

2.4.2 8株無(wú)乳鏈球菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 針對(duì)于分離出的無(wú)乳鏈球菌構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果分為4個(gè)組別，其中WZ5和WZ7在一個(gè)分支上，差異性不大；WZ2、WZ4、WZ8在一個(gè)分支上，表明它們之間差異不大；WZ1、WZ6、WZ3則在另一個(gè)分支上(圖6)。

圖6 8株無(wú)乳鏈球菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 The phylogenetic tree of 8 strains of Streptococcus agalactiae 16S rRNA

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 大腸埃希氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 13株大腸埃希氏菌對(duì)12種常見(jiàn)藥物都出現(xiàn)了不同程度的耐藥。其中頭孢噻吩和復(fù)方新諾明的耐藥率高于50%，在治療時(shí)可以避免選擇使用頭孢噻吩和復(fù)方新諾明。13株大腸埃希氏菌對(duì)鏈霉素、卡那霉素、頭孢曲松的敏感率低于50%，但是中介率分別都在30%以上。13株大腸埃希氏菌對(duì)環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星的敏感率達(dá)到50%以上，特別是頭孢他啶和環(huán)丙沙星的敏感率分別達(dá)到76.9%和84.6%(表3)。

表3 分離的13株大腸埃希氏菌對(duì)常見(jiàn)的12種藥物敏感試驗(yàn)Table 3 Sensitivity test of 13 isolated strains of Escherichia coli to 12 common drugs

2.5.2 無(wú)乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離出的8株無(wú)乳鏈球菌對(duì)11種常見(jiàn)藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥。特別是對(duì)青霉素G、復(fù)方新諾明、克拉霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、紅霉素、慶大霉素這7種藥物的耐藥率可達(dá)60%以上，其中對(duì)青霉素G和復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)87.5%。四環(huán)素和卡那霉素的耐藥率和敏感率均是50%；環(huán)丙沙星的耐藥率為0，分別表現(xiàn)出高度敏感和中度敏感；分離出的8株無(wú)乳鏈球菌對(duì)阿米卡星表現(xiàn)為高度敏感性，敏感率達(dá)到75%(表4)。

表4 分離的8株無(wú)乳鏈球菌對(duì)常見(jiàn)的11種藥物敏感試驗(yàn)Table 4 Sensitivity test of 8 strains of Streptococcus agalactiae to 11 common drugs

2.5.3 大腸埃希氏菌、無(wú)乳鏈球菌的多重耐藥性 從分離出的大腸埃希氏菌和無(wú)乳鏈球菌的多重耐藥結(jié)果顯示，13株大腸埃希氏菌中有6株分別對(duì)3種、4種、5種、6種、8種和9種藥物耐藥，多重耐藥率可達(dá)46%。無(wú)乳鏈球菌有2株分別對(duì)5種、6種藥物耐藥，2株對(duì)9種藥物耐藥，2株對(duì)10種藥物耐藥，多重耐藥率可達(dá)75%。無(wú)乳鏈球菌的耐藥情況比較嚴(yán)重，都出現(xiàn)了對(duì)10種藥物耐藥的菌株(圖7)。

圖7 多重耐藥結(jié)果Fig.7 Multi-drug resistance results

2.7 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.7.1 大腸埃希氏菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 13株大腸埃希氏菌通過(guò)PCR檢測(cè)15種耐藥基因，結(jié)果為：sul1的檢出率為84.6%，TEM的檢出率為76.9%，pbp2B的檢出率為61.5%，sul2的檢出率為38.4%，tetA的檢出率為23.1%，gyrA的檢出率為15.4%，aacC2、tetM的檢出率為7.7%，aacC4、addA、pbp1A、OXA、IMP、DHA、parC的檢出率均為0。部分菌株耐藥基因sul1(263 bp)、sul1(236 bp)、aacC2(648 bp)、tetM(568 bp)、pbp2B(268 bp)、TEM(259 bp)均檢出，其余耐藥基因均未檢出(圖8)。

M.DNA Marker DL 2 000;1～15.sul1、sul2、aacC2、aacC4、tetM、addA、tetA、pbp1A、pbp2B、TEM、OXA、IMP、DHA、gyrA、parC

2.7.1 無(wú)乳鏈球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 8株無(wú)乳鏈球菌通過(guò)PCR檢測(cè)15種耐藥基因，結(jié)果為：sul1、sul2、pbp1A、pbp2B、TEM的檢出率為100%,aacC2的檢出率為50%，OXA的檢出率為25%，gyrA、parC、addA的檢出率為12.5%，aacC4、tetM、tetA、IMP、DHA的檢出率為0。部分菌株耐藥基因sul1(263 bp)、sul2(236 bp)、aacC2(648 bp)、pbp1A(489 bp)、pbp2B(268 bp)、TEM(259 bp)、gyrA(474 bp)、parC(568 bp)均檢出，其余未檢出(圖9)。

M.DNA Marker DL 2 000;1～15:sul1、sul2、aacC2、aacC4、tetM、addA、tetA、pbp1A、pbp2B、TEM、OXA、IMP、DHA、gyrA、parC圖9 部分菌株15種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Detection results of 15 drug resistance genes in selected strains

3 討論

奶牛乳房炎是一種常見(jiàn)的疾病，主要致病菌為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌,對(duì)奶牛養(yǎng)殖造成極大的危害[14-15]。寧夏吳忠地區(qū)主要分離菌大腸埃希氏菌和無(wú)乳鏈球菌是引起該地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)生的主要病原菌,不同地區(qū)的相同病原菌對(duì)抗生素的耐藥程度也有差異。該地區(qū)分離出的大腸埃希氏菌和無(wú)乳鏈球菌兩種病原菌主要對(duì)頭孢他啶、阿米卡星和環(huán)丙沙星比較敏感，對(duì)頭孢噻吩、青霉素G和復(fù)方新諾明耐藥性較高，這與薛梅等對(duì)山東濰坊奶牛乳房炎病原菌主要對(duì)青霉素耐藥的結(jié)果相同，對(duì)四環(huán)素耐藥的結(jié)果有差異[16]，這可能是由于地區(qū)不同，病原菌對(duì)藥物的敏感性不同所造成的。新疆地區(qū)奶牛乳房炎分離出的無(wú)乳鏈球菌主要對(duì)青霉素耐藥[17],這與本地區(qū)無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素耐藥的結(jié)果一致。

經(jīng)耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌對(duì)磺胺類sul1、sul2基因的檢出率較高，這與大腸埃希氏菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥性較高相符合，也與姚偉等對(duì)遼寧地區(qū)大腸埃希氏菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果相近，都是磺胺類耐藥基因檢出率高[18]，可能是由于磺胺類藥物的濫用，導(dǎo)致不同地區(qū)的大腸埃希氏菌對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。大腸埃希氏菌氨基糖苷類aacC2、aacC4耐藥基因的檢出率低，經(jīng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示大腸埃希氏菌對(duì)于妥布霉素、卡那霉素、慶大霉素以及阿米卡星的總體的敏感率較高，結(jié)果也相符。關(guān)于β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp2B、TEM的檢出率較高，這與藥敏試驗(yàn)對(duì)于頭孢曲松相對(duì)于耐藥相符；這與張震等所報(bào)道blaTEM基因攜帶率(最高為90.1%)相差不大[19]，TEM在大腸埃希氏菌中的檢出率普遍較高。對(duì)于頭孢他啶的敏感性較高可能與β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1A、OXA、IMP、DHA的檢出率均為0有關(guān)。氟喹諾酮類基因gyrA的檢出率為15.4%、parC的檢出率為0，這與大腸埃希氏菌對(duì)環(huán)丙沙星較敏感的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

無(wú)乳鏈球菌經(jīng)耐藥性基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)sul1、sul2、pbp1A、pbp2B、TEM的檢出率為100%,與藥敏試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合后發(fā)現(xiàn)該地區(qū)無(wú)乳鏈球菌確實(shí)對(duì)復(fù)方新諾明、和青霉素G高度耐藥相符；對(duì)于gyrA、parC的檢出率為12.5%，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)乳鏈球菌對(duì)與環(huán)丙沙星表現(xiàn)出高度敏感和中度敏感相對(duì)應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，耐藥基因檢出率越高，則相對(duì)應(yīng)的藥敏試驗(yàn)的耐藥性就越高；耐藥基因的檢出率越低，則相對(duì)應(yīng)的藥敏試驗(yàn)的敏感性則越高[20]。對(duì)比本試驗(yàn)對(duì)于四環(huán)素類耐藥基因檢出率低，但試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)四環(huán)素只存在50%的敏感率，從菌株而言，可能存在對(duì)其他四環(huán)素類耐藥基因檢出。本試驗(yàn)分離得到的無(wú)乳鏈球菌主要表現(xiàn)出對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率較高，這與王愛(ài)媛[12]等對(duì)海南地區(qū)無(wú)乳鏈球菌耐藥基因研究相一致，可能是由于β-內(nèi)酰胺類藥物被作為治療無(wú)乳鏈球菌的一線藥物被廣泛推薦使用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。通過(guò)檢測(cè)大腸埃希氏菌和無(wú)乳鏈球菌的耐藥基因，并結(jié)合藥敏結(jié)果，為寧夏吳忠地區(qū)奶牛乳房炎的臨床治療和預(yù)防用藥提供了參考依據(jù)。