TGF-β1在布魯氏菌致炎過(guò)程中的作用及其與NLRP3炎癥小體的相關(guān)性研究

陶婷婷，趙天藝，李 佳，朱德馨，邱潤(rùn)輝，王梓行，孫志華,2,3*，張 輝,2,3*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3.動(dòng)物健康養(yǎng)殖國(guó)家國(guó)際聯(lián)合研究中心，新疆石河子 832000)

布魯氏菌(Brucella)通過(guò)脂多糖(LPS)等病原相關(guān)分子模式被宿主細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，引起炎癥反應(yīng)[1-2]。NOD樣受體家族(NLR)作為PRRs中的一類(lèi)，是構(gòu)成NLRP3炎癥小體的主要成分，NLRP3炎癥小體能夠被多種病原微生物所激活[3-4]。NLRP3 炎癥小體在布魯氏菌感染小鼠過(guò)程中被激活而引起的炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體的抗感染免疫作用[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)超蛋白家族在免疫炎癥反應(yīng)方面主要抑制 T、B 淋巴細(xì)胞的增殖分化，降低NK細(xì)胞的殺傷作用和補(bǔ)體系統(tǒng)的溶菌作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和對(duì)抗病原微生物反應(yīng)能力[6-7]。但是有關(guān)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (TGF-β1)在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的促進(jìn)或抑制作用機(jī)理尚不夠清楚。本文通過(guò)比較布魯氏菌感染宿主前后 TGF-β1的釋放量和在其 mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)，初步探討 TGF-β1 在布魯氏菌感染中的扮演角色，旨在闡述 TGF-β1 在布魯氏菌感染引發(fā)的炎癥尤其在關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，進(jìn)一步研究分析布魯氏菌在體內(nèi)和體外感染宿主過(guò)程中通過(guò)激活 NLRP3 炎癥小體誘發(fā)的炎癥反應(yīng)與 TGF-β1 抑炎或促炎的相關(guān)性，為布魯氏菌致炎分子機(jī)制及布魯氏菌性關(guān)節(jié)炎的抗體治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；Brucellaabortus2308株由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；普通級(jí)昆明小鼠購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊疾控中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；Recombinant Hunman TGF-β1(100-2C)，Peprotech公司產(chǎn)品；TRIzol，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；RNase-free-water、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；Rabbit Anti-TGF Beta 1 antibody (bs-0103R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TGF-β1抗體，abcam公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，Bioworld公司產(chǎn)品；NC膜，Solarbio公司產(chǎn)品；DAB顯色液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 (TGF-β1)、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒，美國(guó)RD公司產(chǎn)品；10×PBS，北京索萊寶公司產(chǎn)品；TRYPTONE SOYA AGAR(TSA)、TRYPTONE SOYA BTOTH(TSB)，英國(guó) OXOID 公司產(chǎn)品；TGF-β1、β-actin引物，華大基因公司合成(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物及序列Table 1 Sequences of primers used for real-time qPCR

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(HIQ-X100)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；聚丙烯凝膠電泳儀(DYY-8B)，北京六一生物科技有限公司；半干式電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌感染重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1預(yù)處理的巨噬細(xì)胞RAW264.7 將RAW264.7細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，取0.01 mg /mL的rTGF-β1蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)共孵育12 h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牛種布魯氏菌2308菌株，8 000 r/min 離心2 min，用PBS清洗菌體2次～3次，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，按照100∶1(細(xì)菌個(gè)數(shù)∶細(xì)胞個(gè)數(shù))的比例感染巨噬細(xì)胞RAW264.7，陰性對(duì)照加入與等體積的PBS，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度的環(huán)境下共培養(yǎng)1 h，預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗RAW264.7細(xì)胞2次后，加入新鮮含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，加入50單位的慶大霉素于培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育45 min，以殺死胞外布魯氏菌。預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗RAW264.7細(xì)胞2次～3次后，加入新鮮的含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在不同的時(shí)間段(0、4、12、24 h)收集細(xì)胞上清和沉淀備用。

1.2.2 構(gòu)建布魯氏菌感染小鼠TGF-β1抗體治療模型 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的布魯氏菌，離心收集菌體，用生理鹽水漂洗2遍，將菌液稀釋至5×106CFU/mL，采用腹腔注射法將布魯氏菌以5×106個(gè)劑量感染小鼠，對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。分別在感染后第1周、第2周、第3周、第4周采集小鼠外周血，收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟于液氮和福爾馬林溶液中備用。在造模后第28天采用尾根靜脈注射法注射TGF-β1抗體，每只小鼠注射約500 μL濃度為1 μg/mL的TGF-β1抗體，對(duì)照組注射相同體積的PBS緩沖液。分別在注射后第1周～第4周收集小鼠外周血血清。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平的變化 分別在布魯氏菌感染RAW264.7細(xì)胞和rTGF-β1預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞0、4、12、24 h后棄去培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS緩沖液潤(rùn)洗3次，按照Invitrogen公司的Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取。用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA在260 nm/280 nm處吸光度(OD260/280)值以確定其純度；取5 μL提取樣品經(jīng)10 mL/L甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。以提取的RNA為模板，采用康為世紀(jì)cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，以cDNA為模板，采用RT-qPCR進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)的相對(duì)定量分析，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)TGF-β1及炎性因子IL-1β和IL-18的釋放量 在布魯氏菌感染 RAW264.7細(xì)胞0、4、12、24 h后收集細(xì)胞上清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。小鼠感染布魯氏菌后，在第1周～第4周采用摘除眼球法收集小鼠外周血，此外收集TGF-β1抗體治療的后第1周～第4周小鼠外周血，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行相關(guān)因子含量測(cè)定。

1.2.5 Western blot檢測(cè)布魯氏菌感染宿主細(xì)胞過(guò)程TGF-β1在蛋白水平變化情況 分別在巨噬細(xì)胞感染布魯氏菌4、12、24、48 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗3次，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液的比例，用移液槍反復(fù)吹打，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，冰上放置裂解10 min后，將裂解物收集至EP管中，13 000 r/min離心10 min，收集上清，即為蛋白樣品，置-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。利用SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Rabbit Anti-TGF-β1 antibody作為一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育2 h，洗膜后，在NC膜上加1 mL DAB顯色液，顯色3 min～5 min后，照相保存。

1.2.6 病理切片和免疫組化 分別在布魯氏菌攻毒后第1周～第4周后分別從試驗(yàn)組和對(duì)照組各取3只小鼠，采用頸部脫臼法處死，迅速打開(kāi)腹腔，迅速摘取小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，制作病理切片，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)TGF-β1在小鼠肝臟、腎臟和脾臟中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中TGF-β1的表達(dá)

流產(chǎn)布魯氏菌2308感染小鼠巨噬細(xì)胞胞內(nèi)寄生存活過(guò)程中，胞內(nèi)TGF-β1 mRNA表達(dá)量在不同的感染時(shí)間點(diǎn)(0、4、12、24 h)與對(duì)照組 PBS相比均出現(xiàn)不同程度的變化，其中在細(xì)菌侵染細(xì)胞初期(0 h)TGF-β1 mRNA表達(dá)量均顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，而在進(jìn)入胞內(nèi)后與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著的變化(圖1)。在感染0、4、12、24 h 后通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白抽提試劑盒步驟提取細(xì)胞總蛋白，按BCA法定量后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠檢測(cè)，用半干濕轉(zhuǎn)膜法檢測(cè)TGF-β1在蛋白表達(dá)水平的表達(dá)(圖2)，在不同的侵染時(shí)間點(diǎn)TGF-β1在蛋白水平上逐步呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且差異顯著(P<0.001)。用ELISA法檢測(cè)細(xì)菌感染細(xì)胞過(guò)程中TGF-β1的分泌情況，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的濃度值，結(jié)果顯示，布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞因子TGF-β1的濃度在4、12、24 h含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05 )，且持續(xù)升高(圖3)。

圖1 侵染細(xì)胞中TGF-β1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The expression of TGF-β1 gene in Brucella infected cells

圖2 WB檢測(cè)感染細(xì)胞中TGF-β1蛋白水平的變化Fig.2 The protein levels of TGF-β1 in Brucella infected cells detected by Western blot

圖3 TGF-β1炎性因子在布魯氏菌感染細(xì)胞中的變化趨勢(shì)Fig.3 The trends of TGF-β1 in Brucella infected cell model

2.2 布魯氏菌感染小鼠外周血血清中TGF-β1含量

建立布魯氏菌感染小鼠模型，分別在感染1、2、3、4周后收集感染鼠外周血血清，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，感染組小鼠血清中炎性因子 TGF-β1的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，但在感染第2周后逐步表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，并且各感染組之間也存在差異(圖4)。

圖4 布魯氏菌感染模型小鼠外周血中TGF-β1含量Fig.4 The levels of TGF-β1 in peripheral blood of miceafter Brucella infection

2.3 TGF-β1預(yù)孵育細(xì)胞后布魯氏菌感染細(xì)胞中IL-1β和IL-18的分泌情況

用ELISA檢測(cè)布魯氏菌侵染rTGF-β1預(yù)孵育的巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌，與對(duì)照組相比，4 h時(shí)TGF-β1預(yù)處理組IL-18的分泌量無(wú)顯著差異，其余各時(shí)間段炎癥因子IL-1β和IL-18釋放量顯著升高(P<0.05)，表明 TGF-β1在布魯氏菌侵染過(guò)程中誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮一定作用(圖5)。

圖5 細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β和IL-18的含量Fig.5 The contents of IL-1β and IL-18 in cell supernatant

2.4 TGF-β1在布魯氏菌感染小鼠臟器中的表達(dá)

小鼠感染布魯氏菌后，主要表現(xiàn)為肝臟組織中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞核溶解、消失，細(xì)胞壞死，少數(shù)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性；脾臟組織出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)，局部組織有淤血；腎臟腎小管上皮細(xì)胞腫脹導(dǎo)致腎小管內(nèi)徑變小，部分腎小管上皮細(xì)胞溶解，腎間質(zhì)有出血和充血現(xiàn)象。通過(guò)免疫組化檢測(cè)TGF-β1在肝臟和脾臟中的變化情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，布魯氏菌感染組肝臟和脾臟組織著色較深，表明TGF-β1 在布魯氏菌感染小鼠肝臟和脾臟中均出現(xiàn)不同程度的高表達(dá)(圖6)。

圖6 TGF-β1在布魯氏菌感染鼠肝臟和脾臟中的表達(dá)(IHC)Fig.6 The expressions of TGF-β1 in spleen and liver of mice infected with Brucella

2.5 TGF-β1抗體干預(yù)后對(duì)布魯氏菌感染鼠血清中IL-1β和IL-18的影響

布魯氏菌感染小鼠后，分別在在感染后1周～4周收集小鼠外周血，檢測(cè)血清中炎性因子IL-1β和IL-18的分泌量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，感染組小鼠血清中炎性因子IL-1β和IL-18的表達(dá)量均顯著升高 (P<0.05)，且各侵染組之間也存在差異(圖7 A,B)。建模后28天，尾根靜脈注射TGF-β1抗體，探究TGF-β1在布魯氏菌誘發(fā)的炎癥的影響，在注射TGF-β1后第1天、第15天、第30天收集小鼠外周血，檢測(cè)血清中炎性因子IL-1β和IL-18的釋放量。結(jié)果顯示，且與對(duì)照組相比，感染組注射TGF-β1抗體后IL-1β和IL-18的釋放量顯著下降(P<0.05)，且在布魯氏菌感染小鼠TGF-β1抗體干預(yù)組呈時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)(圖7 C,D)。初步表明注射TGF-β1抗體可以引起NLRP3炎癥小體相關(guān)因子IL-1β和IL-18的釋放量降低，緩解了炎癥反應(yīng)。

3 討論

布魯氏菌病是一種變態(tài)反應(yīng)性人獸共患傳染病，給人類(lèi)和畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的危害，嚴(yán)重影響著人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的快速發(fā)展[8-9]。布魯氏菌感染哺乳動(dòng)物期間通過(guò)改變PAMP的關(guān)鍵分子來(lái)逃避宿主的天然免疫應(yīng)答并在宿主免疫系統(tǒng)中建立一個(gè)利于自身存活或復(fù)制的微環(huán)境。布魯氏菌含有非典型的LPS結(jié)構(gòu)，侵染宿主后通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合引起微弱的炎癥反應(yīng)或延遲反應(yīng)，如通過(guò)與NLR結(jié)合導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的活化而引起的炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體的早期抗感染免疫作用[10]。

TGF-β1是一種調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽，主要由血小板、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞分泌，可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)諸多細(xì)胞，參與細(xì)胞的復(fù)制、分化以及血管和骨骼的形成，與組織增生修復(fù)密切關(guān)聯(lián)[11-12]。TGF-β1的在免疫反應(yīng)中主要表現(xiàn)為阻礙T、B淋巴細(xì)胞的增殖、對(duì)NK細(xì)胞的活性和T細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行下調(diào)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬能力。布魯氏菌感染除了導(dǎo)致典型的波浪熱等癥狀外可引起關(guān)節(jié)疼痛、腫大或關(guān)節(jié)炎等非典型癥狀，這種布魯氏菌性關(guān)節(jié)炎類(lèi)似于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13-14]。在小鼠前交叉韌帶切斷(ACLT)骨關(guān)節(jié)炎模型中，改變機(jī)械負(fù)荷可引起軟骨下骨中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)被激活[15-16]。與野生鼠相比，TGF-β1受體敲除鼠減少了ACLT后骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，表明TGF-β1在關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)及治療中有重要作用。

A、B.布魯氏菌感染前后IL-1β和IL-18的釋放量;C、D.TGF-β1 抗體干預(yù)治療后IL-1β和IL-18的釋放量A，B.IL-1β and IL-18 releases before and after Brucella infection;C,D.IL-1β and IL-18 releases after TGF-β1 antibody intervention圖7 小鼠血清中炎癥因子IL-1β和IL-18的含量Fig.7 The contents of IL-1β and IL-18 in mouse sera

布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后TGF-β1在細(xì)胞上清中的含量顯著增加，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，同時(shí)TGF-β1在蛋白水平和mRNA水平均顯著升高。布魯氏菌感染小鼠的外周血血清中TGF-β1的釋放量也出現(xiàn)不同程度的升高，并在小鼠臟器中也有所表達(dá)。表明TGF-β1參與了布魯氏菌致炎機(jī)制的調(diào)控。本文研究了布魯氏菌在體內(nèi)和體外感染宿主過(guò)程中激活NLRP3炎癥小體誘發(fā)的炎癥反應(yīng)與TGF-β1抑炎或促炎的相關(guān)性，證實(shí)外源性TGF-β1可以導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18的增加，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。綜上可知，布魯氏菌感染可以激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，布魯氏菌感染可以誘導(dǎo)TGF-β1的高表達(dá)，而高濃度的TGF-β1進(jìn)一步促進(jìn)了NLRP3炎癥小體激活引發(fā)的炎癥反應(yīng)，為布魯氏菌致炎機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。