布勞恩脂蛋白對大腸埃希氏菌感染導致的小鼠體內(nèi)細胞因子分泌及死亡的調(diào)節(jié)作用

鞏志國，顧柏臣，沈 媛，李茜如，金 鳳，趙佳敏，劉 博

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是一種常見的革蘭氏陰性菌，普通菌無致病性[1]。但致病性大腸埃希氏菌可導致多種感染性疾病，如尿路感染、血液感染和膿毒癥[2]。大腸埃希氏菌感染導致的疾病可分為腸道疾病和腸道外疾病[3]。在大腸埃希氏菌感染宿主過程中，炎癥反應強度與細胞因子分泌具有密切關聯(lián)[4]。這一過程始于病原體相關分子模式被宿主天然免疫系統(tǒng)的模式識別受體，進而誘導細胞因子和趨化因子等炎性介質(zhì)的表達[5]。脂多糖(LPS)存在于革蘭氏陰性菌外膜中，是誘導宿主天然免疫應答激活的有效激動劑。LPS被Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)識別，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，進而介導促炎性細胞因子和趨化因子的分泌，最終激活免疫細胞[6]。

除LPS外，布勞恩脂蛋白(BLP)亦是大腸埃希氏菌外膜成分之一，是一種具有免疫活性的細菌脂蛋白，可通過TLR2的識別激活，在宿主體內(nèi)誘導一種類似于LPS的內(nèi)毒素反應[7]。表明大腸埃希氏菌感染的內(nèi)毒素反應不僅與LPS有關，還依賴于BLP的存在。人工合成細菌脂蛋白Pam3CSK4可激活單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，并在C3H/HEN和C3H/HEJ小鼠中引起致死性休克。此外，人工合成細菌脂蛋白Pam3CSK4除可作為TLR2的激動劑誘導宿主炎癥反應外，其介導的耐受現(xiàn)象也可發(fā)揮一定的保護效應，使小鼠免受LPS、活細菌和膿毒癥導致的死亡。本文分析了BLP對大腸埃希氏菌感染后小鼠體內(nèi)細胞因子分泌、臟器損傷和小鼠死亡情況，為闡明BLP在調(diào)控大腸埃希氏菌感染導致的宿主炎癥反應中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、藥品和抗體 PBS緩沖液，Hyclone公司產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基，Oxoid公司產(chǎn)品；T-PER組織裂解液和BCA蛋白定量試劑盒，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒，Biolegend公司產(chǎn)品；小鼠IL-10 ELISA試劑盒，Bioscience公司產(chǎn)品；小鼠RANTES試劑盒，Peprotech公司產(chǎn)品；兔抗HMGB1多克隆抗體，Novus Biologicals公司產(chǎn)品；兔抗HABP2單克隆抗體和Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗，Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6J健康小鼠，8周齡～10周齡，體重約22 g，購自南京大學模型動物研究所。

1.1.3 儀器設備 多功能酶標儀，Bio-Tek公司產(chǎn)品；低溫高速離心機，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；組織勻漿儀，杰靈儀器制造有限公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡，Zeiss公司產(chǎn)品；冰凍切片機，SLEE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 野生型大腸埃希氏菌(鑒定證書號SYS110017，BLP表達陽性)由本課題組分離鑒定并保存[8]。大腸埃希氏菌JE5505(BLP表達陰性，CGSC #6672)從美國耶魯大學大腸埃希氏菌基因儲存中心獲得。2株大腸埃希氏菌生長性狀一致，且可互相作為感染對照菌株加以應用[9]。在-80℃低溫保存的菌液在4℃環(huán)境中融化后，轉(zhuǎn)移至100 mL已滅菌的LB肉湯培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min恒溫搖床中連續(xù)培養(yǎng)12 h。用酶標儀檢測菌液OD600nm值大約為0.9時，表明其處于對數(shù)生長期。將菌液混勻后取1 mL到無菌無酶離心管中，3 000 r/min離心6 min，棄上清，用無菌PBS溶液重懸菌液3次，最后用1 mL PBS緩沖液重懸細菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗處理 1×108C57BL/6J小鼠腹腔注射1×108CFU野生型大腸埃希氏菌，1×108CFU大腸埃希氏菌JE5505或1×108CFU大腸埃希氏菌JE5505與BLP(10 mg/kg)聯(lián)合刺激作為處理組，腹腔注射等體積PBS作為未感染對照組。觀察小鼠存活情況，每組20只小鼠。注射后3 h和6 h后采血，用離心管收集血液，傾斜放置在室溫環(huán)境中2 h后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中過夜。1 500 r/min離心5 min取上層血清，置于-80℃?zhèn)溆?。分別收集感染3 h，6 h和12 h后小鼠的肝臟及肺臟，將收集的新鮮臟器迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 促炎性細胞因子和趨化因子的表達 將在-80℃低溫保存的血清、肝臟和肺臟置于4℃環(huán)境下緩慢解凍，稱取0.04 g肺臟和肝臟于研磨管中，加入T-PER組織裂解液300 μL。隨后置于組織研磨儀進行研磨，重復研磨2次，1 500 r/min離心20 min，收集上清液重復離心1次，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，將處理好的肝臟和肺臟上清樣品液稀釋同樣濃度。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清、肝臟和肺臟中TNF-α、IL-1β、RANTES和IL-10的分泌水平。

1.2.4 肝臟和肺臟損傷標記物HMGB1和HABP2蛋白的表達 將在-80℃低溫保存的肝臟和肺臟移至4℃環(huán)境下緩慢解凍，取小塊組織使用包埋劑將其包埋處理后，用冰凍切片機切成6 μm厚的切片，隨后用冷丙酮固定10 min。固定完成后的切片在含2.5 mL/L吐溫的冷PBS中清洗3次，每次10 min。隨后室溫下用含有50 mL/L牛血清白蛋白的封閉液孵育1 h。加入兔抗HMGB1多克隆抗體或兔抗HABP2單克隆抗體，在4℃避光條件中孵育過夜。孵育完成后，用含2.5 mL/L吐溫的PBS洗滌3次，每次15 min，然后用Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗在室溫條件下避光孵育1 h。用共聚焦顯微鏡進行圖像采集(100倍)，并進行熒光強度分析。

1.2.5 統(tǒng)計分析 用GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計并進行差異性分析(3次重復試驗數(shù)據(jù)Mean±SD，One-Way ANOVA)，以P<0.05視為差異顯著(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

2 結果

2.1 BLP對大腸埃希氏菌感染導致小鼠死亡的影響

用野生型大腸埃希氏菌(1×108CFU)、大腸埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)與BLP(10 mg/kg)聯(lián)合感染刺激后進行小鼠死亡情況的分析。結果表明(圖1)，在感染28 h后，野生型大腸埃希氏菌感染試驗組小鼠存活率為85%，而大腸埃希氏菌JE5505感染試驗組小鼠全部死亡。在感染40 h后，野生型大腸埃希氏菌感染試驗組小鼠方出現(xiàn)全部死亡的現(xiàn)象。JE5505與BLP聯(lián)合組刺激小鼠20 h后小鼠不在出現(xiàn)死亡上述結果表明，BLP對大腸埃希氏菌感染導致的小鼠死亡具有一定的保護作用，可在一定程度上避免小鼠出現(xiàn)由感染導致的快速死亡。

圖1 大腸埃希氏菌感染后小鼠的死亡情況Fig.1 Mortality of mice infected with E.coli

2.2 BLP對大腸埃希氏菌感染后小鼠肝臟、肺臟和血清中細胞因子分泌水平的影響

用野生型大腸埃希氏菌(1×108CFU)、大腸埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)與BLP(10 mg/kg)聯(lián)合感染刺激后分析小鼠肝臟、肺臟和血清中促炎性細胞因子(TNF-α和IL-1β)、抗炎因子(IL-10)和趨化因子(RANTES)的分泌水平。結果表明(圖2)，與未感染對照組相比，使用野生型大腸埃希氏菌、大腸埃希氏菌JE5505或JE5505與BLP聯(lián)合感染刺激3 h和6 h后，小鼠肝臟、肺臟和血清中TNF-α、IL-1β、IL-10和RANTES分泌水平均出現(xiàn)顯著上升(P<0.01)。感染3 h或6 h后，與野生型大腸埃希氏菌感染組和JE5505與BLP聯(lián)合感染刺激組小鼠相比，大腸埃希氏菌JE5505感染組小鼠肝臟、肺臟或血清中TNF-α、IL-1β和RANTES處于較高水平，而IL-10處于較低水平。表明BLP對大腸埃希氏菌感染后小鼠肝臟、肺臟和血清中促炎性細胞因子和趨化因子的分泌水平具有下調(diào)作用，而對抗炎因子的分泌水平具有上調(diào)作用。

圖2 大腸埃希氏菌感染后小鼠肝臟、肺臟和血清中細胞因子的分泌水平Fig.2 Secretion of cytokines in liver,lungs and serum of mice infected with E.coli

2.3 BLP對大腸埃希氏菌感染后小鼠肝臟和肺臟組織損傷的影響

用野生型大腸埃希氏菌(1×108CFU)和大腸埃希氏菌JE5505(1×108CFU)和JE5505(1×108CFU)與BLP(10 mg/kg)聯(lián)合感染刺激12 h后分析小鼠肺臟和肝臟中組織損傷標志物HABP2和HMGB1的表達情況。結果表明(圖3)，與未感染對照組相比，野生型大腸埃希氏菌、大腸埃希氏菌JE5505或JE5505與BLP聯(lián)合感染刺激后，小鼠肝臟和肺臟中HABP2和HMGB1的表達均顯著上升(P<0.001)。與野生型大腸埃希氏菌組和JE5505與BLP聯(lián)合感染刺激小鼠相比，大腸埃希氏菌JE5505感染組小鼠肝臟或肺臟中HABP2和HMGB1的表達顯著處于較高水平。表明BLP對大腸埃希氏菌引起的小鼠臟器中組織損傷標志物HMGB1和HABP2的蛋白表達具有下調(diào)作用。

圖3 大腸埃希氏菌感染后小鼠肝臟和肺臟中組織損傷標志物HABP2和HMGB1的表達情況Fig.3 Expression of tissue damage markers HABP2 and HMGB1 in liver and lungs of mice infected with E.coli

3 討論

細菌感染可引起全身性炎癥反應，導致宿主膿毒癥或感染性休克[10]。大腸埃希氏菌LPS是一種細菌內(nèi)毒素，是造成宿主感染后發(fā)生膿毒癥的主要原因之一，但LPS并不是大腸埃希氏菌唯一誘導宿主產(chǎn)生炎癥反應的免疫生物活性成分。細菌脂蛋白也可使宿主產(chǎn)生炎癥反應。在大腸埃希氏菌菌體成分中，BLP是一種可以誘導TLR2激活的細菌外膜成分，且與大腸埃希氏菌引起的宿主體內(nèi)細胞因子分泌和內(nèi)毒素休克具有緊密關系[7]。本研究結果表明，BLP對大腸埃希氏菌感染導致的小鼠體內(nèi)細胞因子分泌、臟器損傷和隨后發(fā)生的小鼠死亡均具有體一定的調(diào)控作用。

與野生型大腸埃希氏菌(BLP表達陽性)相比，缺乏免疫生物活性成分BLP的大腸埃希氏菌JE5505在感染小鼠后，造成宿主死亡更迅速。BLP在大腸埃希氏菌感染引起的宿主死亡中發(fā)揮了一定的作用(圖1)，可能是通過宿主對細菌脂蛋白形成的耐受實現(xiàn)的。細菌感染導致宿主死亡的主要原因是嚴重的全身性炎癥反應，而細胞因子和趨化因子的分泌是炎癥反應強度的關鍵指標[4,11]。大腸埃希氏菌感染可引起宿主體內(nèi)促炎性細胞因子包括TNF-α和IL-1β的分泌，進而介導局部和全身性炎癥反應，以及臟器損傷過程。IL-10作為一種抗炎因子在細菌感染和宿主炎癥反應中，對組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮了重要作用[12]。本研究分析了BLP對大腸埃希氏菌感染后小鼠體內(nèi)促炎細胞因子、抗炎細胞因子和趨化因子的分泌，以及臟器組織損傷標志物的表達是否具有調(diào)控作用。

結果表明，BLP的存在對大腸埃希氏菌感染后小鼠血清、肺臟和肝臟中的促炎細胞因子(TNF-α和IL-1β)和趨化因子(RANTES)的分泌水平均有下調(diào)作用，而對抗炎細胞因子(IL-10)的分泌水平有上調(diào)作用(圖2)。BLP對大腸埃希氏菌感染引起的小鼠肝臟和肺臟中HABP2和HMGB1表達有下調(diào)作用。說明在大腸埃希氏菌感染過程中，BLP可能通過下調(diào)宿主的全身炎癥反應，對臟器損傷產(chǎn)生一定保護作用，從而避免由細菌感染導致的宿主快速死亡。

在細菌感染過程中宿主對細菌脂蛋白的耐受可能是一種重要的病原-宿主調(diào)節(jié)機制。如人工合成細菌脂蛋白Pam3CSK4可以誘導宿主免疫細胞形成對脂多糖的交叉耐受，從而下調(diào)人單核細胞TNF-α的分泌。人工合成細菌脂蛋白Pam3CSK4可誘導宿主對感染性休克的耐受，并保護小鼠免受LPS引起的致死現(xiàn)象。BLP可能在大腸埃希氏菌感染過程中誘導宿主形成耐受現(xiàn)象，進而通過對細胞因子和趨化因子分泌的調(diào)控，對小鼠臟器損傷和死亡產(chǎn)生保護作用。該現(xiàn)象可能是病原微生物與宿主之間形成的一種共生平衡，通過延長宿主的生存時間，進而為大腸埃希氏菌在宿主體內(nèi)的繁殖創(chuàng)造更有利的條件，該現(xiàn)象的具體機制有待進一步研究。