廣西部分豬場豬流行性腹瀉病毒S基因克隆及序列分析

李春英，何奇松，馮淑萍，楊可妍，曾詠芳，熊 毅，顏健華

(1.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.欽州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西欽州 535099；3.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；4.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)屬于冠狀病毒科的成員，引起豬特別是仔豬的急性腸道傳染病[1-2]。20世紀70年代，英國首次報道發(fā)現(xiàn)PEDV。隨后歐洲其他國家以及中國、韓國和日本等亞洲國家的豬場也都暴發(fā)了豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)。2010年后，PED席卷全國各地的豬場，并且造成大量仔豬感染和死亡，而現(xiàn)有疫苗免疫保護性差[3]。各階段的豬都可感染，而且日齡越小特別是哺乳仔豬發(fā)病率高，病死率也高[4]。目前，PED為我國養(yǎng)殖業(yè)嚴重的豬傳染病之一[5]。因此，對PDEV流行株的S基因進行全基因克隆測序，研究廣西當前流行的PEDV變異特征，對研發(fā)有效的PEDV疫苗和控制PEDV的流行具有重要意義。PEDV的S基因編碼的蛋白為表面的糖基化纖突蛋白，與病毒適應(yīng)外部環(huán)境的能力和宿主內(nèi)毒力存在密切聯(lián)系[6]。S蛋白可以調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞特定受體之間的作用，是病毒侵入宿主細胞的媒介，刺激機體中和抗體的產(chǎn)生。S蛋白是一種Ⅰ型糖蛋白，有1383個氨基酸，含有1個信號肽、1個跨膜結(jié)構(gòu)、4個中和抗原位點和1個結(jié)構(gòu)域[7]。根據(jù)PEDV和其他冠狀病毒S蛋白的同源性特征，將其S蛋白分為S1和S2兩個區(qū)域。S1區(qū)域是1-789位氨基酸，S2區(qū)域是790-1383位氨基酸[8-10]。因此，研究S蛋白有助于在開發(fā)PEDV疫苗時候選擇適宜的疫苗群。近年來PED在國內(nèi)各養(yǎng)殖場感染情況增加，這可能提示PEDV已經(jīng)產(chǎn)生了新的變種。一直以來，S基因是分析PEDV當前流行特點一個重要基因[11-12]。S蛋白的受體結(jié)合域和抗原表位與病毒入侵宿主和介導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體存在著很大關(guān)聯(lián)。本研究通過對當前流行毒株的全S基因進行克隆、測序，以了解廣西地區(qū)PEDV流行特征和遺傳進化樹特點，為更好防控PEDV提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和病料 PEDV野毒株陽性病料由廣西動物疫病預(yù)防控制中心家畜診斷科鑒定并保存；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、PEDV、豬輪狀病毒(G型)三聯(lián)活疫苗作為實驗陽性對照，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；病料為廣西7個市(縣、地區(qū))的25個豬場采集的疑似感染PEDV的豬淋巴結(jié)或者糞便。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA核酸提取試劑盒、通用型膠回收試劑盒、DH5α大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞、TIANprep Mini Plasmid kit質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、抑制酶HIR、DNA Marker DL 2 000、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、PMD-18T質(zhì)粒載體、EXTaq，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，SENSO公司產(chǎn)品；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，北京市六一儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照PEDV經(jīng)典毒株CV777株的S基因序列，利用Oligo引物設(shè)計軟件設(shè)計了S1、S2、S3、S4和S5共5對引物對PEDV進行全S基因擴增，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物稀釋成 25 pmol/μL后分裝于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?表1)。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2.2 總RNA的提取 根據(jù)核酸抽提試劑盒的操作步驟提取病毒總RNA，最后溶于25 μL ddH2O，用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成病毒 cDNA將獲得的病毒RNA根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說明書進行操作 ，獲得的cDNA產(chǎn)物用于RT-PCR擴增或是-20℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄體系：15.0 μL RNA模板，2.0 μL dNTPs，0.5 μL M-MLV，5.0 μL 5×buffer，2.0 μL下游引物，0.5 μL HIR。反轉(zhuǎn)錄程序：95℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄42℃ 1 h。

1.2.4 目的片段PCR擴增 分別用S1、S2、S3、S4和S5共5引物對S基因5個片段分別進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2.0 μL dNTPs，2.5 μL 10×buffer，上、下游引物各0.5 μL，0.1 μL ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，最后加ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；95℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 40 s，進行35個循環(huán)；最后72℃ 10 min。目的產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.5 PCR產(chǎn)物回收、克隆和測序 根據(jù)操作規(guī)程用天根生化有限公司回收目標PCR產(chǎn)物，用pMD18-T載體與其連接后4℃過夜，然后轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細胞中，涂于LA 培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h～16 h，挑取單個白色菌落，接至LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)17 h。將獲得的培養(yǎng)物2 mL提取重組質(zhì)粒，雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒定，篩選出兩者均為陽性的菌株送寶生物工程(大連)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 全S基因的RT-PCR擴增結(jié)果

用自己設(shè)計的5對引物對41株樣品的S2、S1、S3、S4、S5進行擴增，所獲得5個目標片段與預(yù)期的1 019、1 129、820、899、876 bp大小符合。將回收目標DNA克隆測序(圖1)。

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.S2,S1,S3,S4,S5圖1 CHGXXA014-222012株的5個S基因片段擴增電泳Fig.1 The electrophoresis results of amplified fragments of CHGXXA014-222012 five S genes

2.2 酶切鑒定

將各片段擴增產(chǎn)物進行膠回收，與載體PMD18-T進行連接轉(zhuǎn)化到DH5α感受太細胞，涂板，單個菌落培養(yǎng)，然后進行雙酶切鑒定(圖2)。

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.S4,S2,S1,S3,S5；6.Negative control圖2 CHGXXA014-222012株S基因5個片段酶切電泳Fig.2 The electrophoresis of CHGXXA014-222012 five fragments of S gene digested with restriction endonucleases

2.3 S基因序列同源性分析結(jié)果

對41份陽性樣品進行全S基因測序，用生物軟件將所有毒株的5個擴增片段進行拼接。結(jié)果顯示，所得的廣西PEDV全S基因存在核苷酸插入和缺失。核苷酸組成個數(shù)分別有4161、4158、4149、4176、4164、4140個。測序的41份樣品的全S基因的核苷酸同源性在94.8%～100%。與Attenuated-DR13、CV777株、韓國株Spk1、HuN和日本株NK等參考毒株的核苷酸同源性見圖3。

2.4 S基因遺傳進化樹

用生物軟件DNAstar將本研究的41株S基因核苷酸與下載的PEDV參考株進化樹圖譜繪制(圖3)。圖譜顯示，本研究的41株與65株參考毒株可分為3個譜系，Cluster1包含本研究的CHGXLC055-92013、CHGXLC055-52013、CHGXG P035-72013、CHGXGP035-82013共4株毒株和Attenuated-DR13、CV777等參考株。本研究剩余毒株和韓國株Spk1、HuN和日本株NK等參考毒株屬于Cluster3。Cluster2只有Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK等參考毒株。

圖3 PEDV S基因進化樹圖譜Fig.3 Phylogenetic tree of PEDV S gene

本研究毒株所屬的Cluster3與Cluster2 Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK參考毒株核苷酸同源性為92.7%～96.3%；與Cluster1 CV777、Attenuated-DR13核苷酸同源性為92.8%～94.2%；與Cluster3韓國株Spk1、HuN和日本株NK等參考毒株核苷酸同源性為93.2%～99.4%。而本研究毒株所屬Cluster1的毒株與Cluster2 Brl-87、KPED-9、JS-2004-2、DR13、LZC、Chinju99、CH-S、83p-5和MK參考毒株核苷酸同源性為92.5%～98.1%，與Cluster3韓國株Spk1、HuN和日本株NK等參考毒株之間的核苷酸同源性為92.9%～95.8%，與Cluster1 CV777、Attenuated-DR13之間核苷酸同源性為95.7%～97.5%。

2.5 抗原位點氨基酸變化情況分析

將獲得的41株全S基因和CV777的氨基酸進行比對。結(jié)果顯示，CHGXLC055-52013、CHGXGP035-82013、CHGXGP035-72013和CHG XLC055-92013共4株毒株在S1功能區(qū)的139-140位有2個氨基酸缺失，在140處有1個氨基酸缺失，在163-164位處有氨基酸插入。在S1功能區(qū)234-238位處，CHGXLC224-22012株有5個氨基酸插入。

參照經(jīng)典疫苗株CV777，本研究41毒株在MMR區(qū)域共有54個地方發(fā)生了氨基酸點突變。392位由K→R、377位由K→D、364位的E→A、362位由V→A、357位由T→A、355位由I→T、323位由F→S、281位由W→L。除了經(jīng)典參考株CV777株和CHGXGP035-82013、CHGXGP035-72013、CHGXLC055-92013、CHGXLC055-52013共4株毒株外，其余37株毒株在265位氨基酸由L→V、299位由M→I；除了CHGXXA010-32012毒株外，其余40株毒株在第308位都由A→V。CHGXNN028-12013在2C10區(qū)的氨基酸有在1個突變。在SS5區(qū)第750位氨基酸，CHGXNN026-62013株由I→L。在SS6區(qū)的第765位氨基酸，本研究所有毒株由D→S。在S1P1表位區(qū)和S1P3表位區(qū)的氨基酸突變數(shù)分別是8和7(圖4)。

圖4 S基因部分抗原區(qū)域推定的氨基酸序列比較Fig.4 Comparison of deduced amino acid sequences of S genes

3 討論

本研究毒株進化樹圖譜結(jié)果顯示，廣西當前流行的PEDV毒株屬于2個譜系，Cluster1包括CHGXLC055-52013、CHGXLC055-92013、CHGX GP035-72013和CHGXGP035-82013和參考毒株CV777。Cluster3包括本研究其余37株毒株和韓國株Spk1、HuN和日本株NK等參考毒株。說明廣西當前流行的PEDV與CV777、LZC等國內(nèi)早期毒株存在較大的差異，進化樹親緣關(guān)系比較遠；與日本株NK、韓國株Spk1、HuN在進化樹圖譜上親緣關(guān)系比較近。該結(jié)果也與鄭逢梅等的研究結(jié)果類似[13]。說明全國各地PEDV出現(xiàn)了新變種。為了更好防控PEDV的侵襲，研究當前流行的PEDV遺傳特征有益于開發(fā)合適的疫苗。本研究結(jié)果與已有報道結(jié)果相似[14]。

S蛋白可分為S1和S2兩個功能區(qū)，對冠狀病毒S1亞基的研究對了解病毒的變異特征有幫助[15]。研究結(jié)果表明，廣西當前流行的PEDV與經(jīng)典疫苗株相比存在較大氨基酸缺失、插入和突變，并主要發(fā)生在S1功能區(qū)。如在59-62位氨基酸處，經(jīng)典疫苗株CV777等參考毒株都有4個氨基酸缺失；在60位氨基酸處，本研究的有37株毒株與CH-SDQD-2011和CH8等參考毒株存在缺失。在140位處氨基酸處，只有參考經(jīng)典疫苗株CV777有缺失。SS5和SS6比較保守。廣西當前流行的PEDV與中國疫苗株CV777存在比較大變異，提示以經(jīng)典毒株制備的疫苗在防控PEDV侵蝕時可能無法為豬群提供良好的免疫保護效果。廣西當前流行PEDV毒株氨基酸的突變是否會引起生物學(xué)功能的改變有待研究。

廣西當前流行的PEDV毒株抗原表位區(qū)域存在較大變異，與CV777、LZC等國內(nèi)早期毒株存在差異較大，親緣關(guān)系比較遠。提示源自經(jīng)典毒株CV777的疫苗在防控PEDV入侵時可能不會產(chǎn)生良好的免疫保護效果。